iCell-011 細胞HE染色

HE染色全名為蘇木精(hematoxylin)和伊紅(eosin)染色方法，是基本的也是重要的病理學染色技術。

       HE染色是目前國內外病理診斷上廣泛采用的 常規(guī)染色方法。一張好的HE切片是保證正確病理診斷的關鍵。切片質量的好壞，可直接影響疾病診斷的及時與準確性。作為一個合格的實驗技術員，能制作出一張高質量的HE染色切片，是必須掌握的一門重要功課。
        HE染色的實驗原理及注意事項
       一、細胞核染色原理：
       蘇木精為堿性天然染料，可使細胞核著色。細胞核內染色質的成分主要是DNA，在DNA的雙螺旋結構中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋的外側帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性燃料以離子鍵或氫鍵結合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。
       二、細胞漿染色原理：

       細胞漿內主要成分是蛋白質，為兩性化合物、細胞漿的染色與pH值有密切關系，當pH調到蛋白質等電點4.7-5.0時，胞漿對外不顯電性，此時酸或堿性染料不易染色。當pH調到6.7-6.8時，大于蛋白質的等電點pH值，表現(xiàn)酸性電離，而帶負電荷的陰離子，可被帶正電荷的染料染色，現(xiàn)時胞核也被染色，核和胞漿難以區(qū)分。因此必須把pH調至胞漿等電點以下，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷（陽離子），就可被帶負電荷（陰離子）的染料染色。伊紅Y是一種化學合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質的氨基正電荷（陽離子）結合而使細胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結締組織，嗜伊紅顆料等被感染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明的對比。

HE染色

       三、分化作用：
       染色后，用某些特定的溶液將組織過多結合的染色劑脫去，這個過程稱為分化作用，所用的溶液稱為分化液。在HE染色中用0.5%鹽酸乙醇作為分化液，因酸能破壞蘇木精的醌型結構，使組織與色素分離而褪色。經蘇木精染色后，必須用0.5%鹽酸乙醇分化，使細胞核過多結合的蘇木精染料和細胞漿吸附的蘇木精染料脫去，在進行伊紅染色，才能保證細胞核與細胞漿染色的分明。因此，在HE染色中分化是極為關鍵的一步。
       四、返藍作用：
       分化之后，蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，呈紅色，在堿性條件下處于藍色離子狀態(tài)，呈藍色。組織切片經0.5%鹽酸乙醇分化后呈紅色或粉紅色，故分化之后，立即用水除去組織切片上的酸而終止分化，再用弱堿性水（0.2%氨水）使蘇木精染上的細胞核呈現(xiàn)藍色，這個過程稱為返藍作用或藍化作用。另外用自來水浸洗也可使細胞核返藍，但所需時間較長。
       實驗材料
       固定液：常用95%乙醇和冰丙酮
       蘇木精染液：稱取蘇木精粉0.5g，銨礬24g溶解于70ml蒸餾水中，然后取NaIO 31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均勻，濾紙過濾，備用。
       伊紅染液：稱取0.5g水溶性伊紅染液，溶于100ml蒸餾水中。
       稀鹽酸乙醇溶液：用75%乙醇配制1%鹽酸。
       系列濃度的乙醇、二甲苯、中性樹膠。
       培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、眼科鑷、蓋玻片、載玻片、顯微鏡。
       實驗步驟
       樣品制備：對于貼壁生長細胞，胰酶消化，調整細胞濃度約1×105/ml，滴加于蓋玻片上(置于6孔板中)，培養(yǎng)相應時間后，取出細胞爬片，用PBS 洗滌3次。
       樣品固定：95%乙醇固定20min，PBS洗滌2次，每次1min。
       染核：蘇木素染液染色2-3min，自來水洗滌。
       分色：鏡下觀察，若細胞核染色過深，用1%鹽酸酒精溶液分色數(shù)秒，自來水洗滌。
       染胞質：浸入伊紅染液染色1min，自來水洗滌。
       吹干或自然晾干細胞 爬片后，中性樹膠封片。
       若細胞用4%多聚甲醛固定，則染色時間相應延長，蘇木素染色12-15min，伊紅5min即可。
       實驗結果及注意事項

       實驗結果

       細胞核呈藍色，細胞質，肌纖維，膠原纖維和紅細胞呈不同程度的紅色。鈣鹽和細菌可呈藍色或紫藍色

       注意事項：
       1.  染色時調節(jié)pH值很重要。如果組織塊在福爾馬林中固定時間長，組織酸化而影響細胞核著色。因此，要在自來水中沖洗時間長一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30min，這樣可以使細胞核著色較深。染伊紅時胞漿著色不佳，可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。
       2.  切片染蘇木精后，分色這一步是關鍵，應在顯微鏡下控制進行，一般以細胞核染色清楚（晰）而細胞質基本無色為佳。如果過分延長分色時間將導致染色太淺，應重新染色后再行分色。
       3.  切片經酒精脫水后，入二甲苯時可出現(xiàn)白色不透明狀態(tài)，此為脫水不*，應將切片退回*，更換酒精、二甲苯，以求*脫水與透明。

       4.  在染色過程中不要讓切片干燥，以免切片收縮、變形，影響神經元形態(tài)。

       5.  切片從二甲苯取出或進入二甲苯前，切片周邊均應擦干凈或吸干多余水分。

       6.  后封固時，要用中性樹脂，防止日后褪色，蓋片要選大于組織塊的面積，如漏出一部分不久將會褪色，所用樹脂濃度要適當，樹脂封固時不能有氣泡。

服務流程：

    1.聯(lián)系我們，溝通客戶實驗計劃及目標，評估實驗的的可行性。    

    2.依照客戶要求，設計相應的實驗；或客戶已有實驗方案發(fā)送給我們，我們研究方案的可操作性。    

    3.確定終的實驗方案，報價和周期。    

    4.簽訂服務合同，支付預付款。    

    5.開始實驗服務，并定期向客戶反饋和交流。    

    6.實驗完成，提供完整實驗說明和部分實驗結果。    

    7.支付尾款，向客戶提供完整的全部實驗報告和原始數(shù)據。    

    8.項目完成。