XSL0134 帕金森動物模型 神經(jīng)系統(tǒng)模型

帕金森動物模型  神經(jīng)系統(tǒng)模型

6羥多巴胺、MPTP注射至帕金森模型 經(jīng)典誘發(fā)性帕金森病動物模型，多采用利xue平、6-OHDA、MPTP誘導(dǎo)嚙齒類和靈長類動物法。

造模機制

1．利血ping是一種生物復(fù)合物，可以通過封閉囊內(nèi)不可逆的單胺的運輸，消耗中樞和外周的單胺，導(dǎo)致肌 肉僵硬，姿勢彎曲，運動減慢或無能，從而出現(xiàn)了與帕金森病相似的臨床癥狀。

2．6-OHDA和DA的結(jié)構(gòu)相似。在動物機體內(nèi)，6-OHDA被轉(zhuǎn)送至兒茶酚胺類神經(jīng)通路吸收系統(tǒng)，6-OHDA 代謝導(dǎo)致眾多氧化應(yīng)激現(xiàn)象，由于自由基的形成最終使得DA神經(jīng)元抗過氧化系統(tǒng)破壞，隨著自由基對線粒 體功能的損傷，其膜穩(wěn)定性和DNA完整性的破壞，最終致使細(xì)胞死亡。 在注射6-OHDA的30分鐘內(nèi)即可觀察到6-OHDA對DA神經(jīng)元毒害作用，注射14～26天90％以上DA細(xì)胞丟 失。將不同劑量的6-OHDA定位注射于大鼠的黑質(zhì)周圍和黑質(zhì)紋狀體通路上均能夠選擇性損毀黑質(zhì)內(nèi)DA神 經(jīng)元，可模擬出自發(fā)性帕金森病的原始病理過程，最終產(chǎn)生類似自發(fā)性帕金森病。

3．黑質(zhì)選擇性毒物MPTP，本身不具有神經(jīng)毒性，但可以穿越血-腦脊液屏障，并主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞和 5-HT能神經(jīng)元內(nèi)的單胺氧化酶B作用后轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘缘?-甲基-4苯基吡啶離子(MPP+)，然后釋放到細(xì)胞 外，Mpp+不能穿越血-腦脊液屏障，而是經(jīng)由DA轉(zhuǎn)運體進入DA能神經(jīng)末梢和胞體。

MPP+對DA細(xì)胞的選擇性毒性源于它被選擇性攝入神經(jīng)元，一旦進入DA神經(jīng)元末梢，MPP+被逆行轉(zhuǎn)運至 黑質(zhì)，從而通過干預(yù)線粒體，引起脂質(zhì)過氧化，使得膜結(jié)構(gòu)紊亂，影響細(xì)胞功能，最終導(dǎo)致選擇性破壞黑 質(zhì)DA能神經(jīng)元，導(dǎo)致黑質(zhì)DA能神經(jīng)元大量死亡，紋狀體酪an酸羥化酶陽性纖維大量喪失，紋狀體DA及其 代謝產(chǎn)物3,4-二羥基.苯y(tǒng)i酸、高香草酸水平均明顯降低，也有黑質(zhì)紋狀體小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞的增生和藍(lán)斑、下丘腦等區(qū)的損傷，與帕金森病患者的改變基本相同。

實驗方法

1.Wistar大鼠，體重200~220g，10周，腹腔內(nèi)注射一定劑量的li血平后可使其出現(xiàn)骨骼肌便硬、震顫。身體屈曲、運動減少及其他的一些類似的帕金森病臨床主要運動癥狀。

2．6-OHDA損傷大鼠帕金森病模型，6-OHDA定向性注射通常定位于中間前腦束，而不是黑質(zhì)致密區(qū)，因 為前者包含了所有傳出于黑質(zhì)致密層和前側(cè)蓋區(qū)的DA能神經(jīng)束。

因此，與注射于黑質(zhì)致密區(qū)相比，當(dāng)6-OHDA注射在中間前腦束時，DA細(xì)胞丟失更多，而且6-OHDA在中 間前腦柬導(dǎo)致?lián)p傷的病理變化與觀察到的自發(fā)性帕金森病有強的相關(guān)性。常用的6-OHDA損傷的大鼠帕 金森病模型是6-OHDA單側(cè)損傷大鼠帕金森病模型。它是用6-OHDA單側(cè)注射大鼠中腦黑質(zhì)誘發(fā)的單側(cè)中 腦黑質(zhì)DA神經(jīng)元損毀模型。

立體定向毀損具體過程如下，將經(jīng)反復(fù)行為檢測確認(rèn)無旋轉(zhuǎn)行為的大鼠進行實驗。

采用間隔注射兩點法制模：

① 腹腔注射10％水合氯.醛(40mg/kg)將大鼠麻醉后，固定于Stoelting腦立體定向yi上(使雙側(cè)耳桿尖duan插入 外耳道，可聽到“咔嚓”聲，并使頭部兩側(cè)保持在水平位置；門齒勾低于耳桿平面2.4mm，使前、后囟水平 高度相差0.4mm以下)。

② 常規(guī)消毒后，切開頭皮約1.0cm，剝離骨膜，確定右側(cè)黑質(zhì)致密部和中腦腹側(cè)被蓋坐標(biāo)，用針尖標(biāo)記。③ 牙科鉆小心鉆透顱骨(注意勿損傷硬腦膜)，按確定坐標(biāo)將微量注射器連接于微量推進器上，垂直入顱， 緩慢進針到預(yù)定深度，向黑質(zhì)致密區(qū)和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)各注射6-OHDA 8μg(溶于4μl含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％抗 壞血酸的生理鹽水中)，注射深度應(yīng)以針孔斜面中點為參照點，針尖向前，保證6-OHDA能準(zhǔn)確注入預(yù)定部 位，注射速度為1μl/min，留針10分鐘，緩慢退針(1mm/min)。

⑤ 牙科膠覆蓋鉆孔，常規(guī)縫合傷口，連續(xù)腹腔注射青mei素5萬U一周以防止感染。

3．大鼠對MPTP不敏感，不易誘發(fā)與帕金森病臨床相似的動物模型，雖然小鼠相對敏感，但在 30mg/(kg·d)劑量5～10天的作用下，黑質(zhì)A10區(qū)、藍(lán)斑、背核及下丘腦的神經(jīng)元仍不受任何影響。制作 MPTP非人靈長類帕金森病模型常采用非人靈長類動物全身靜脈、淺靜脈、頸總靜脈或腹腔注射 MPTP方 法進行。選用成年非人靈長類動物，注射 MPTP(0.2～0.5mg/kg)，每天1次，共15～18天，也有報道僅用 4～6天(劑量大小不同、年齡選擇差異、注射部位和途徑不同造成的差別)，所有動物均能出現(xiàn)帕金森病樣 癥狀，與人體產(chǎn)生的癥狀相似。

模型特點

1．運用li血平誘發(fā)的大鼠帕金森病模型對快速評價治療帕金森病的藥物具有重要的價值。該模型迅速易 得，但其癥狀會產(chǎn)生可逆性變化，該模型的缺點是不能深入復(fù)制自發(fā)性帕金森病的病理過程。 因此，不能用于慢性DA消耗時產(chǎn)生的一些臨術(shù)變化的研究。該模型的另一缺陷在于，它與自發(fā)性帕金森病 相比，當(dāng)5-HT、去甲腎.上.腺.素降到一個很低的水平時，可能導(dǎo)致兩者產(chǎn)生不同的藥理學(xué)反應(yīng)。另外，通 過注射酪an酸類似物(1-甲基酪an酸)，可抑制DA和去甲腎.上.腺.素的合成，對嚙齒類動物具有與li血平誘 導(dǎo)相似的功效，因此可選擇此方法復(fù)制帕金森病模型。

2．由于同側(cè)紋狀體DA功能的喪失，動物表現(xiàn)出向與6-OHDA引起的損傷部位相反側(cè)自發(fā)旋轉(zhuǎn)，暗示神經(jīng) 節(jié)向丘腦和中腦運動區(qū)發(fā)出的沖動減少，該模型對于了解黑質(zhì)紋狀體通路降解時病理、電生理和藥理學(xué)變 化非常有用，有利于我們對帕金森病癥狀產(chǎn)生機制的理解。假設(shè)在帕金森病中這種沖動屬于過量運動，那 么這種行為所代表著的就是抗帕金森病的作用。 盡管6-OHDA單側(cè)損傷復(fù)制的大鼠帕金森病模型與帕金森病患者在病理學(xué)、藥理學(xué)的變化相似，但是這種 動物模型仍存在一些缺點。由于在這個模型中6-OHDA的損傷屬單側(cè)，通過大腦非損傷側(cè)補償介導(dǎo)的通 路，可以影響大腦的單側(cè)作用DA消耗的改變。6-OHDA制備的大鼠模型需要立體定向儀等特殊設(shè)備，制作 技術(shù)要求高，但大鼠易控制，來源廣，價格低，行為持續(xù)時間長且觀察方便，因而是常用的模型之一。

3.MPTP誘導(dǎo)的嚙齒類動物模型所表現(xiàn)的癥狀和病理變化與人帕金森病臨床主要體征相去甚遠(yuǎn)。目前看來沒有太大的推廣價值，MPTP制備的非人尋長類帕金森病模型方法簡單，行為體征，病里特征與人類更相似，加之非人靈長類進化上的類人性、觀察和取材的易操作性，而廣泛受到人們的歡迎。此模型明顯優(yōu)于6-0HDA模型，是目前應(yīng)用廣泛的模型，

轉(zhuǎn)基因動物模型 應(yīng)用基因工程等實驗技術(shù)對動物基因組進行有目的的遺傳修飾，這種被修飾改造的基因可穩(wěn)定遺傳給后代 動物。基因敲除和轉(zhuǎn)基因是基因修飾帕金森病動物模型的主要制作方法。

造模機制

1．DJ-1是一種重要的帕金森病相關(guān)致病基因，DJ-1基因敲除小鼠或DJ-1表達下調(diào)的DA能細(xì)胞對氧化應(yīng)激 的敏感性增加，細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力降低及相應(yīng)信號通路發(fā)生改變，致使神經(jīng)元凋亡加速，從而可能制作 出帕金森病基因修飾動物模型。

2．原核顯微注射法是目前制作轉(zhuǎn)基因動物常用的方法。將構(gòu)建好的a-synuclein基因直接注射到受精卵 的雄原核中，然后將攜帶外源基因的受精卵移植到同品系假孕受體的輸卵管中，可獲 a-synuclein轉(zhuǎn)基因小 鼠，發(fā)現(xiàn)該小鼠Lewy小體形成加快、神經(jīng)元凋亡增加。

模型特點

作為遺傳易感性受到多基因聯(lián)合作用的疾病，任何單一基因修飾因素在帕金森病致病中都會有一定作用，但都不起主要作用或決定性作用。

因此，通過現(xiàn)有的基因修飾知識和技術(shù)，制作的帕金森病動物模型都有缺陷，表現(xiàn)出單一的神經(jīng)化學(xué)紊亂 模似性或神經(jīng)bing理變化模似性，其表型特點(特別是細(xì)微特征)與帕金森病患者都有較大差異。

模型評估和應(yīng)用

探索中的帕金森病基因修飾動物模型必然有其廣闊的應(yīng)用前景，但同時尚存許多問題有待克服。因此，現(xiàn) 階段基因修飾動物模型的應(yīng)用，還暫時只停留在致病機制研究、神經(jīng)元保護措施篩選等研究上。

 需確認(rèn)的信息

1. 模型種屬（大鼠還是小鼠或是其他種屬）

2. 動物體重有無要求，年齡有無要求

3. 雌雄有無要求

4. 模型構(gòu)建具體方案

5. 取材要求（采血、取組織樣本）

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