膠原酶 2 型（生化試劑）

粗制膠原酶制劑包含兩種不同膠原酶的幾種同工酶、一種巰基蛋白酶、氯鏈蛋白酶、一種類似y蛋白酶的酶和一種氨肽酶。這種膠原酶和蛋白酶活性的組合在分解細(xì)胞間基質(zhì)方面非常有效，這是組織解離的關(guān)鍵部分。該復(fù)合物的一個(gè)組成部分是一種水解酶，它優(yōu)先在天然膠原的螺旋區(qū)域中降解，特別是在序列Pro-Y-Gly-Pro中的Y-Gly鍵，其中YZ常是一種中性氨基酸。這種裂解產(chǎn)生的產(chǎn)品容易進(jìn)一步被肽酶消化。粗制膠原酶被金屬螯合劑如半g氨酸、EDTA或鄰苯二酚抑制，但不被DFP抑制。它也被α2-巨球蛋白，一種大型血漿糖蛋白抑制。酶活性需要Ca2+。每種膠原酶t有的酶譜已與用于研究的細(xì)胞來源的組織（或細(xì)胞的使用目的）相關(guān)聯(lián)，因此通過相關(guān)性已建立了幾種類型的粗制膠原酶：類型1、2、3和4。

- 類型1粗制膠原酶具有原始的膠原酶、酪蛋白酶、氯鏈蛋白酶和y蛋白酶活性的平衡。

- 類型2含有較高相對水平的蛋白酶活性，特別是氯鏈蛋白酶。

- 類型3含有Z低水平的次級蛋白酶。

- 類型4設(shè)計(jì)為特別低的y蛋白酶活性，以限制對膜蛋白和受體的損傷。

- 類型5含有更高的膠原酶和酪蛋白酶值。

- 類型6含有高膠原酶活性，酪蛋白酶與膠原酶的比例約為2:1。設(shè)計(jì)為相對于類型I（col G）膠原酶，富含類型II（col H）膠原酶。

- 類型7含有比類型1和2膠原酶高四倍的膠原酶和酪蛋白酶活性。

- 純化膠原酶，代碼：CLSPA，含有Z少的次級蛋白水解活性以及高膠原酶活性。

無動(dòng)物源類型AFA、AFB和AFC，STZ1和STZ2膠原酶是從w全不含動(dòng)物成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)出來的，設(shè)計(jì)用于生物加工應(yīng)用，其中必須防止?jié)撛诘膭?dòng)物源性病原體的引入。次級蛋白酶的水平與類型1和2膠原酶相似。

- CLSAFA是原始的AFA等級，設(shè)計(jì)為具有與類型1和2膠原酶相似的膠原酶和次級蛋白酶。

- CLSAFB含有比CLSAFA更高的膠原酶和酪蛋白酶活性。

- CLSAFC具有類似于類型4膠原酶的特別低的y蛋白酶活性。

- CLSAFD含有比CLSAFA高兩到三倍的特定活性。

- 純化膠原酶，代碼CLSAFP含有Z少的次級蛋白水解活性以及高膠原酶活性。

- STZ1和STZ2，0.22μ過濾STEMxyme AOF膠原酶/z性蛋白酶（Dispase）混合物，用于原代細(xì)胞和干細(xì)胞的分離。

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膠原酶，2 型試劑：

0.05 M TES [三(羥甲基)-甲基-2-氨基乙烷磺酸]緩沖液，含0.36 mM氯化鈣，pH 7.5

4%甲基纖維素溶于7.1 mM氯化錫中

0.2 M檸檬酸鈉，pH 5.0

硝基羥基吲哚-檸檬酸混合液：將50 ml含7.1 mM氯化錫的4%硝基羥基吲哚甲基纖維素與50 ml pH 5.0的0.2 M檸檬酸鈉混合。讓混合物攪拌5分鐘。

50%正丙醇

底物：Worthington牛跟腱膠原（代碼：CL）和無維生素酪蛋白

50%（重量/體積）三氯醋酸

酶：將酶以1 mg/ml的濃度溶解在含有0.36 mM氯化鈣（pH 7.5）的0.05 M TES中。在上述緩沖液中，稀釋液分別為1/10和1/20。

程序：

稱取25 mg沃辛頓牛膠原蛋白，放入四個(gè)試管中。包括至少兩個(gè)管作為不含酶的空白。向試管中加入5.0 ml 0.05 M TES緩沖液，并在37°C下孵育15分鐘。在適當(dāng)?shù)脑嚬苤屑尤?.1毫升酶稀釋液，開始反應(yīng)。

5小時(shí)后，通過將0.2ml溶液（留下膠原）轉(zhuǎn)移到含有1.0ml茚三酮-檸檬酸混合物的試管中來停止膠原酶反應(yīng)。包括酶空白（用0.1ml TES緩沖液代替酶孵育的膠原）。在沸水浴中加熱20分鐘。冷卻后，用5毫升50%正丙醇稀釋。靜置15分鐘，讀取600nm處的吸光度。從L-l氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線確定相當(dāng)于釋放的l氨酸的微摩爾氨基酸。

非特異性蛋白酶活性（即酪蛋白酶活性）使用上述測定法測定，并用25毫克不含維生素的酪蛋白代替膠原蛋白。5小時(shí)后通過加入0.5毫升50%三l乙酸使反應(yīng)停止。離心后，將0.2ml上清液轉(zhuǎn)移到1.0ml茚三酮中，并如上處理。酪蛋白酶活性計(jì)算為膠原酶活性。

文獻(xiàn)參考：

Abe, S. and Nagai, Y.

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An Editorial.

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Angleton, E. and Van Wart, H.

Preparation and Reconstitution with Divalent Metal Ions of Class I and Class II Clostridium histolyticum Apocollagenases , Biochemistry 27 , 7406 , 1988

Ashcroft, S. , Bassett, J. and Randle, P.

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Bagchi, N.

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