單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（smart-seq2）

時下火熱的10X Genomics公司Chromium解決方案無法滿足某些特殊或者少量細(xì)胞樣本甚至單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究。Smart-seq2技術(shù)在單細(xì)胞水平對帶Poly（A）的RNA進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組擴增及高通量測序，能夠滿足高靈敏度、低偏好性的cDNA擴增，得到全長轉(zhuǎn)錄本，實現(xiàn)高水平的序列模板轉(zhuǎn)換。

Smart-seq2技術(shù)有較好的覆蓋范圍，可檢測到稀有轉(zhuǎn)錄本，無需額外的專業(yè)設(shè)備，應(yīng)用范圍較廣，可以解決傳統(tǒng)RNA 定量技術(shù)在早期胚胎發(fā)育、干細(xì)胞、癌癥、免疫等研究領(lǐng)域中存在的樣品量極低或細(xì)胞異質(zhì)性的問題，是在單細(xì)胞水平研究基因表達(dá)強有力的工具，極大地拓展了RNA-seq 的應(yīng)用范圍。

技術(shù)優(yōu)勢：

1、起始量低：1-1000個細(xì)胞或10pg-10ng total RNA即可高效擴增；

2、檢測靈敏度高： 大幅度增加了低表達(dá)基因的檢出量;

3、堿基分辨率高： 可達(dá)單堿基分辨率，且可以定位到具體基因的具體轉(zhuǎn)錄本;

4、實驗可控： 質(zhì)控點多，可從實驗的開端判斷細(xì)胞狀況；

5、轉(zhuǎn)錄本覆蓋度高： 通過雙端引物擴增全長cDNA，獲得全轉(zhuǎn)錄組信息，避免3’端和5’端偏好性，產(chǎn)物完整性好。

實驗策略：

分析內(nèi)容：

送樣要求：

經(jīng)典案例：

Bj?rklund 等利用Smart-seq2單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示人CD127+先天淋巴細(xì)胞的異質(zhì)性

The heterogeneity of human CD127(+) innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing

先天淋巴細(xì)胞（ILCs）是一種免疫細(xì)胞，它通過釋放可溶性的因素調(diào)節(jié)對病毒、細(xì)菌和寄生蟲的早期免疫反應(yīng)。這些細(xì)胞可以根據(jù)細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子被分為三個亞型，每種亞型都有不同的功能。利用流式細(xì)胞儀分選患有阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥患者的扁桃體組織中的ILCs（Lin－CD127+）和NK cells（CD45+Lin－CD127－NKG2A+CD56+CD16－ ）。采用Smart-seq2進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴增建庫；Illumina HiSeq 2000 3M reads /樣本進(jìn)行測序分析。采用PCA（主成分分析）和t-SNE對ILC中847個表達(dá)的基因進(jìn)行分型分析，將細(xì)胞分為4類：ILC1、ILC2、ILC3、NK cells。應(yīng)用SCDE軟件包對4類細(xì)胞的差異基因進(jìn)行分析，找出共有及差異基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD127+ILCs中共有的差異基因的表達(dá)量比NK細(xì)胞中明顯要高。ILC1、 ILC2、ILC3差異基因表達(dá)分析，結(jié)果表明，ILC1 cells共有79個上調(diào)表達(dá)基因，參與干擾素γ的調(diào)控，ILC2 cells共有58個上調(diào)表達(dá)的基因，在前列腺素、Notch信號通路及環(huán)境感應(yīng)中發(fā)揮作用，ILC3 cells共有371個上調(diào)表達(dá)的基因，根據(jù)GO注釋有85個與免疫相關(guān)，且存在未知功能的基因。

采用PCA和t-SNE分析ILC3中1,958個注釋的免疫基因，將ILC3分為3個亞型：Cluster A、Cluster B、Cluster C, 通過對這3種亞型細(xì)胞的分析，發(fā)現(xiàn)了新的免疫細(xì)胞CD62L+ ILC3。本研究通過對648個單細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，應(yīng)用t-SNE細(xì)胞分型、SCDE基因差異表達(dá)分析，在ILC3中發(fā)現(xiàn)新的免疫細(xì)胞CD62L+ ILC3。

參考文獻(xiàn)：

Bjorklund, A.K., et al., The heterogeneity of human CD127(+) innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Immunol, 2016. 17(4): p. 451-60.