化工儀器網(wǎng)>產(chǎn)品展廳>試劑標(biāo)物>常用實(shí)驗(yàn)試劑>其它常用實(shí)驗(yàn)試劑>RC52314-50ML*2 AMEKO試劑：超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物
RC52314-50ML*2 AMEKO試劑：超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物
| 參考價(jià) | ￥ 195 |
| 訂貨量 | ≥1件 |
- 公司名稱 上海聯(lián)碩生物科技有限公司
- 品牌 AMEKO
- 型號(hào) RC52314-50ML*2
- 產(chǎn)地
- 廠商性質(zhì) 經(jīng)銷商
- 更新時(shí)間 2024/11/13 16:31:18
- 訪問次數(shù) 33
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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
|---|
ECL化學(xué)發(fā)光底物（超敏）
產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
RC52314 | ECL化學(xué)發(fā)光底物（超敏） | 100 ml |
RC52314 | ECL化學(xué)發(fā)光底物（超敏） | 500ml |
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
ECL超敏發(fā)光液用于檢測(cè)直接或間接標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP的抗體及其關(guān)聯(lián)的抗原。
產(chǎn)品組份：
產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
RC52314 | 增強(qiáng)型發(fā)光液 A液 | 50ml/250ml |
RC52314 | 穩(wěn)定劑 B 液 | 50ml/250ml |
用途：用于HRP標(biāo)記抗體的Western Blot和HRP標(biāo)記探針的核酸雜交。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
1、靈敏度高：可檢測(cè)低皮克級(jí)的蛋白；
2、信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)：光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)5小時(shí)；
3、穩(wěn)定試劑：工作液在24小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定；
4、成像方法：適用于CCD或激光凝膠成像儀；
5、價(jià)格經(jīng)濟(jì)：針對(duì)稀釋的抗體濃度條件進(jìn)行了優(yōu)化，節(jié)省抗體：
一抗：以1 µg/mL儲(chǔ)存液稀釋1:1,000至1:4,000倍
二抗：以1 µg/mL儲(chǔ)存液稀釋1:2,000至1:5,000倍
6、簡(jiǎn)單易用：可替代其它公司的ECL發(fā)光底物，操作步驟無需進(jìn)行特別優(yōu)化；
使用方法:
1、執(zhí)行常規(guī)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜和Western Blot步驟。注意用HRP標(biāo)記IgG或用一抗-鏈親和素-生物/素-HRP夾法。
2、 Western Blot最后一次洗膜的同時(shí)新鮮配制發(fā)光工作液：分別取等體積的溶液A和B，放入干凈容器中混合。建議立即使用工作液，室溫放置數(shù)小時(shí)后仍可使用但靈敏度略有降低。
3、 用鑷子取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜干燥。將膜浸入發(fā)光工作液（0.125mL發(fā)光工作液/cm2膜）中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3分鐘，準(zhǔn)備立即壓片曝光。孵育時(shí)間過長(zhǎng)不會(huì)增加靈敏度，有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致曝光條帶異常。發(fā)光過程的本質(zhì)是酶促反應(yīng)，使用過少的發(fā)光工作液不利反應(yīng)進(jìn)行，也會(huì)導(dǎo)致膜上條帶曝光不均和明顯降低靈敏度。為達(dá)節(jié)約目的可將膜剪小但勿降低發(fā)光液用量。
4、 用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。
5、 打開X光膠片暗盒，在暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將Western Blot膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來包裹Western Blot膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋Western Blot膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白帶面向上。
6、 暗房?jī)?nèi)壓X光膠片，分別曝光不同的時(shí)間，如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗。建議第一次曝光 60 秒，之后可調(diào)整曝光時(shí)間以達(dá)到最佳結(jié)果。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在底物孵育后的前 5-30 min期間是強(qiáng)烈的。這一反應(yīng)可以持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，但強(qiáng)度會(huì)隨時(shí)間下降，如有底物孵育后較長(zhǎng)時(shí)間后曝光，曝光時(shí)間可能需要延長(zhǎng)以獲得較強(qiáng)信號(hào)。
注意事項(xiàng)：
（1）步驟1～5可在日光燈下操作；但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時(shí)間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。
（2）長(zhǎng)時(shí)間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。
（3）發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。肉眼不可見的熒光實(shí)際上可持續(xù)數(shù)小時(shí)并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時(shí)。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。
（4）由于超敏發(fā)光液極其靈敏，建議按照推薦比例稀釋抗體?？贵w濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導(dǎo)致失敗。
（5）某些保鮮膜包裹印跡膜時(shí)可能會(huì)淬滅熒光，應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。
（6）使用肉眼可見的預(yù)染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可精確確定膠片上條帶的位置和大小。
（7）疊氮鈉是 HRP 的抑制物，不要使用疊氮鈉作為緩沖液的防腐劑。
問題解答：
問題 | 可能問題 | 解決方案 |
膠片上有反轉(zhuǎn)像（即黑色背景，白色帶） |
系統(tǒng)中HRP過多 |
將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍 |
膜上有褐色或黃色帶 | ||
印記在暗室中發(fā)光 | ||
信號(hào)持續(xù)時(shí)間少于8小時(shí) | ||
信號(hào)弱或無信號(hào) | 系統(tǒng)中過多的HRP耗盡了底物并導(dǎo)致信號(hào)迅速衰減 | 將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍 |
抗原或抗體的量不足 | 增加抗體或抗原的量 | |
蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移率低 | 優(yōu)化轉(zhuǎn)印 | |
HRP 或底物活性低 | 見下文注釋 | |
高背景 | 系統(tǒng)中 HRP 過多 | 將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少 10 倍 |
封閉不充分 | 優(yōu)化封閉條件 | |
封閉式機(jī)不合適 | 嘗試一種不同的封閉試劑 | |
洗滌不充分 | 增加洗滌時(shí)間、次數(shù)或洗滌緩沖液體積 | |
膠片過度曝光 | 縮短曝光時(shí)間或使用背景消除劑 | |
抗原或抗體的濃度太高 | 減少抗體或抗原的量 | |
蛋白質(zhì)條內(nèi)有斑點(diǎn) | 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜效率低 | 優(yōu)化轉(zhuǎn)印流程 |
膜的水化不均勻 | 按照制造商建議適度的使膜水化 | |
膠片與膜之間存在氣泡 | 在膠片曝光前，去除氣泡 | |
膠片上背景有斑點(diǎn) | HRP 標(biāo)記二抗中存在聚集物 | 使用 0.2um 的過濾器 |
非特異性條帶 | 系統(tǒng)中 HRP 過多 | 將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍。 |
SDS 導(dǎo)致的蛋白非特異性結(jié)合 | 在檢測(cè)過程中不使用 SDS |
*為檢測(cè)系統(tǒng)活性，在暗室中，在一個(gè)清潔試管中制備1-2ml工作液。關(guān)閉燈，添加1ul未稀釋的HRP標(biāo)記二抗工作液。該溶液應(yīng)當(dāng)立即發(fā)出藍(lán)色光，藍(lán)光信號(hào)在隨后的幾分鐘漸淡。
AMEKO試劑：超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物
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