BODIPY™ 581/591 C11（脂質(zhì)過氧化傳感器）

ODIPY™ 581/591 十一烷酸可用于檢測細(xì)胞和細(xì)胞膜中的活性氧 (ROS)。 染料的多不飽和丁二烯基部分的氧化導(dǎo)致熒光發(fā)射峰從～590 nm移動(dòng)到～510 nm。 在還原狀態(tài)下，BODIPY™ 581/591 十一烷酸的激發(fā)和發(fā)射值為 581/591 nm； 氧化后，激發(fā)和發(fā)射值移至 488/510 nm。

該產(chǎn)品我們建議用高質(zhì)量無水 DMSO 溶解，母液濃度 1 至 10 mM，≤?20°C 避光保存。

BODIPY™ 581/591 C11 檢測脂質(zhì)過氧化的原理

BODIPY™ 581/591 C11的分子結(jié)構(gòu)如圖2所示，染料的多不飽和丁二烯基部分（紅色虛線框）可與ROS發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致染料的熒光發(fā)射峰從～590 nm移動(dòng)到～510 nm。 在還原狀態(tài)下，BODIPY™ 581/591 C11的激發(fā)和發(fā)射值為 581/591 nm，呈現(xiàn)紅色熒光； 經(jīng)氧化后，激發(fā)和發(fā)射值移至 488/510 nm，呈現(xiàn)出綠色熒光。

圖2. BODIPY™ 581/591 C11 檢測脂質(zhì)過氧化的原理²

BODIPY™ 581/591 C11染料使用方法

染料溶解與保存：

BODIPY™ 581/591 C11的分子量為504.4 g/mol。1 mg染料可以使用198 µl 高質(zhì)量無水DMSO溶解成10 mM母液，溶解好的母液于-20 ℃分裝避光保存，避免反復(fù)凍融。

染色流程：

染料的推薦工作液濃度為1-10 µM，可以使用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，孵育時(shí)間建議為30分鐘，的工作濃度和孵育時(shí)間需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行調(diào)整。具體染色流程請參考圖3。

圖3. BODIPY™ 581/591 C11染料使用流程

BODIPY™ 581/591 C11結(jié)果分析

BODIPY™ 581/591 C11適用于多種分析方法（流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡、高內(nèi)涵），比較常用的是流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡。下面，我們分別以這兩種檢測平臺為例，介紹一下結(jié)果分析方法。根據(jù)染料的光譜性質(zhì)，我們可以使用以下通道來進(jìn)行檢測：

*在使用流式細(xì)胞儀檢測還原態(tài)時(shí)，需要使用561nm激光器激發(fā)的PE通道來檢測。對于PE通道使用488nm激光器激發(fā)的流式細(xì)胞儀，建議只檢測FITC通道的信號（如同時(shí)檢測FITC和PE通道，兩個(gè)通道之間存在干擾，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確），這也是大多數(shù)文獻(xiàn)中所使用的方法。

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

典型的流式數(shù)據(jù)如圖4所示,僅使用FITC通道檢測氧化態(tài)，使用直方圖對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。與對照組對比，經(jīng)誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化后，染料氧化態(tài)增加，F(xiàn)ITC通道熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，信號峰右移（圖4A），也可以對氧化態(tài)平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較（圖4B）。

圖4. BODIPY™ 581/591 C11檢測脂質(zhì)過氧化流式結(jié)果分析

 Hypoxia–reoxygenation (HR)誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，RLX處理抑制脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生。³

熒光顯微鏡檢測結(jié)果

典型的熒光顯微鏡成像結(jié)果如圖5所示，分別使用FITC和Texas Red通道來檢測染料的氧化態(tài)和還原態(tài)。經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化后，綠色信號增強(qiáng)（圖5A）。在統(tǒng)計(jì)時(shí)，使用氧化態(tài)與還原態(tài)熒光強(qiáng)度的比值來對不同的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較（圖5B）。氧化態(tài)/還原態(tài)比值越高，說明脂質(zhì)過氧化程度越高。

圖5. BODIPY™ 581/591 C11檢測脂質(zhì)過氧化成像結(jié)果分析⁴

脂質(zhì)過氧化染料常見問題解析

問：BODIPY™ 581/591 C11熒光探針可以兼容固定嗎？

答：BODIPY™ 581/591 C11熒光探針適用于活細(xì)胞檢測，不兼容固定。此外，該染料也不能用于固定后的樣品。

問：樣品中含有GFP熒光蛋白，還可以使用BODIPY™ 581/591 C11熒光探針嗎？如不能，有其他產(chǎn)品推薦嗎？

答：由于BODIPY™ 581/591 C11熒光探針在氧化態(tài)時(shí)呈現(xiàn)綠色，與細(xì)胞中的GFP沖突，因此不建議在含有GFP的樣品中使用此探針檢測脂質(zhì)過氧化。向您推薦B3932，其可以兼容GFP，在還原態(tài)時(shí)，激發(fā)和發(fā)射光波長分別為665/676 nm，被氧化后激發(fā)和發(fā)射光波長會(huì)變成580/605 nm。

參考文獻(xiàn)

1. van Eck, H. J. N., Akkermans, G. R. A., Alonso van der Westen, S., Aussems, D. U. B., van Berkel, M., Brons, S., Classen, I. G. J., van der Meiden, H. J., Morgan, T. W., van de Pol, M. J., Scholten, J., Vernimmen, J. W. M., Vos, E. G. P., & de Baar, M. R. (2019). High-fluence and high-flux performance characteristics of the Superconducting Magnum-Psi Linear Plasma Facility. Fusion Engineering and Design, 142, 26–32. 

2. Wang, F., Naowarojna, N., & Zou, Y. (2022). Stratifying ferroptosis sensitivity in cells and mouse tissues by photochemical activation of lipid peroxidation and fluorescent imaging. STAR Protocols, 3(2), 101189. 

3. Nistri, S., Fiorillo, C., Becatti, M., & Bani, D. (2020). Human relaxin-2 (serelaxin) attenuates oxidative stress in cardiac muscle cells exposed in vitro to hypoxia–reoxygenation. evidence for the involvement of reduced glutathione up-regulation. Antioxidants, 9(9), 774. 

4. Murray, M. B., Leak, L. B., Lee, W. C., & Dixon, S. J. (2023). Protocol for detection of ferroptosis in cultured cells. STAR Protocols, 4(3), 102457.