GLP-1R/CRE熒光素酶報告基因 HEK293

GLP-1R/CRE熒光素酶報告基因HEK293細(xì)胞系是一種工程化的HEK293細(xì)胞系，表達(dá)受cAMP反應(yīng)元件（CRE）控制的螢火蟲熒光素酶和人類GLP-1R（胰高血糖素樣肽1受體；登錄號BC113493）。通過測量熒光素酶活性，可以監(jiān)測這些細(xì)胞中GLP-1R的激活。

GLP-1R/CRE熒光素酶報告基因HEK293細(xì)胞系的功能已通過使用肽類激動劑胰高血糖素樣肽1（7-37）、胰高血糖素樣肽1（7-36）酰胺、Exendin-4、利西那肽、度拉糖肽中的GLP-1部分、塞美格魯肽、曲普瑞肽和Retatrutide的劑量反應(yīng)實驗進行了驗證。該細(xì)胞系還通過使用小分子激動劑Danuglipron的劑量反應(yīng)實驗進行了驗證。GLP-1R/CRE熒光素酶報告基因HEK293細(xì)胞系對激動劑的響應(yīng)是通過劑量依賴性方式誘導(dǎo)熒光素酶活性。使用Exendin（9-39）驗證了該細(xì)胞系中激動劑誘導(dǎo)的熒光素酶活性的抑制。

背景

GLP-1R是B類家族的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs或分泌素樣受體）的成員，是一種主要在胰島β細(xì)胞和腦神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的跨膜蛋白。GLP-1R由肽類激素胰高血糖素樣肽1（GLP-1）激活，有兩種活性形式，GLP-1（7-37）和GLP-1（7-36）酰胺。GLP-1R在控制血糖水平中發(fā)揮重要作用，通過增強葡萄糖刺激的胰島素分泌、葡萄糖、脂質(zhì)代謝和飽腹感。它在大腦中的作用似乎是控制食欲。

研究工作集中在調(diào)節(jié)GLP-1R介導(dǎo)的信號通路作為2型糖尿?。═2DM）的治療方法，并導(dǎo)致了幾種GLP-1 FDA批準(zhǔn)的激動劑的開發(fā)。除了在胰島素分泌中的作用外，GLP-1R激動劑還可以有助于體重管理，降低心血管疾病的潛力，并保護β細(xì)胞。正在研究其在T2DM患者腫瘤發(fā)展中的作用，但需要進一步的研究來w全理解GLP-1R及其激動劑的功能。

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細(xì)胞培養(yǎng)協(xié)議

注意：HEK293細(xì)胞源自人類材料，因此建議采取適當(dāng)?shù)陌踩A(yù)防措施。

細(xì)胞解凍

1. 在37°C水浴中搖晃裝有冷凍細(xì)胞的小瓶大約60秒。細(xì)胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將小瓶的全部內(nèi)容轉(zhuǎn)移到含有10 ml預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基1的試管中。

注意：在37°C水浴中放置細(xì)胞過久將導(dǎo)致活性迅速喪失。

2. 立即以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞在5 ml預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基1中重懸。

3. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時后，檢查細(xì)胞附著和活性。更換培養(yǎng)基為新鮮的解凍培養(yǎng)基1，并繼續(xù)在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好分裂。

5. 細(xì)胞應(yīng)在w全融合前傳代。在s次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長培養(yǎng)基1A。

細(xì)胞傳代

1. 抽去培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞，并用0.05% y酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長培養(yǎng)基1A并轉(zhuǎn)移到試管中。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞在生長培養(yǎng)基1A中重懸。

4. 按照推薦的亞培養(yǎng)比例1:5至1:8，每周一次或兩次將細(xì)胞種入新的培養(yǎng)容器中。

細(xì)胞冷凍

1. 抽去培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的PBS沖洗細(xì)胞，并用0.05% y酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長培養(yǎng)基1A并計數(shù)細(xì)胞。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞在4°C冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸，細(xì)胞濃度約為2 x 10^6個細(xì)胞/ml。

4. 將1 ml的細(xì)胞懸浮液分裝到每個冷凍小瓶中。將小瓶放入保溫容器中緩慢冷卻，并在-80°C下保存過夜。

5. 次日將小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中長期保存。

注意：建議在早期傳代時擴增細(xì)胞并至少冷凍10個小瓶以備將來使用。

圖. 通過流式細(xì)胞儀分析GLP-1R/CRE熒光素酶報告基因HEK293細(xì)胞系表面GLP-1R的表達(dá)。

GLP-1R/CRE熒光素酶報告基因HEK293細(xì)胞（綠色）或?qū)φ誄RE熒光素酶報告基因HEK293細(xì)胞（藍(lán)色）使用人類GLP-1R PE偶聯(lián)抗體（R&D Systems #FAB2814P）染色，并通過流式細(xì)胞儀分析。Y軸代表細(xì)胞數(shù)量百分比。X軸表示PE的強度。

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)\CRISPR、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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