疫苗專題：乳佐劑制備與理化結(jié)構(gòu)特性

隨著亞單位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、抗*性抗體疫苗等各種新型疫苗的出現(xiàn)，免疫佐劑的研究越來越被人們關(guān)注，臨床應(yīng)用也越來越廣泛。這些新型疫苗雖然具有抗原性良好、毒性低等優(yōu)點，但因其免疫原性低，需要配合高效免疫佐劑的使用。免疫佐劑可以先于抗原或與抗原同時使用，能夠非特異地增強機體對抗原的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，而自己本身并無抗原性。對于很多傳染病，因缺乏合適的佐劑而影響重組蛋白、多肽、菌苗、DNA疫苗、毒苗等的發(fā)展。因此，對于傳染病的防控不僅是研發(fā)高效低毒的疫苗，免疫佐劑的研發(fā)也至關(guān)重要。

乳佐劑簡述

油乳型佐劑是指將一定比例的油相和水相物料通過乳化，制備成油包水（W/O）或水包油（O/W）形式的乳劑。油乳型佐劑具有促進(jìn)多種抗原產(chǎn)生高效價的抗體、使抗原連續(xù)刺激的時間相對延長、抗原接種的劑量減少、抗原接種的次數(shù)降低的優(yōu)點。目前市場上常見的油乳佐劑主要有弗氏佐劑、白油 Span 佐劑、MF-59、ISA 206、ISA720、佐劑－65、SAF 等，其中人用疫苗多用水包油佐劑。

研究表明，粒徑是影響納米粒在體內(nèi)運輸和被抗原遞呈細(xì)胞吞噬的重要因素。從細(xì)胞吞噬的角度來看，小于1μm的納米粒子更容易被DC和巨噬細(xì)胞吞噬，粒徑小于1μm適合引發(fā)系統(tǒng)免疫。從粒子傳輸?shù)慕嵌葋砜?，小粒徑的納米粒(<100nm)更易通過淋巴管進(jìn)行傳輸從而提高免疫效果，但是粒徑過小納米粒會滲入到血管中，過大又會影響其在淋巴管中的傳輸速度。因此粒徑在20-50nm范圍內(nèi)的納米粒是疫苗佐劑的佳粒徑范圍。但與此同時，目前上市和處于臨床研究階段的相應(yīng)納米級乳劑佐劑(如MF59、AS01-04系列、NB001-002系列等)，其粒徑均大于160nm，使得納米級(1-100nm) 藥用制劑所具有的顆粒尺小、比表面積大、表面能高、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等優(yōu)勢無法充分發(fā)揮，同時上述佐劑亦不具有類似鋁鹽佐劑的良好蛋白抗原吸附能力，在一定程度上使疫苗的免疫保護(hù)效力及免疫持久性受到了限制。

納米免疫佐劑中的納米乳免疫佐劑，是一個由油、水、表面活性劑和助表面活性劑四部分組成、粒徑為1~100nm、液滴多為球形，大小均勻，透明或半透明、具有熱力學(xué)穩(wěn)定性和各向同性、熱壓滅菌或高速離心穩(wěn)定不分層、制備的條件溫和、可自發(fā)形成的膠體分散系統(tǒng)。

納米乳佐劑對疫苗具有以下顯著優(yōu)勢：

(1)可抵抗體液的稀釋和蛋白酶降解，從而保護(hù)抗原，增強藥物吸收、提高抗原的生物利用率。

(2)促進(jìn)疫苗的抗原攝取和遞呈，提高藥效。

(3)促進(jìn)機體的免疫系統(tǒng)作用。

(4)提高藥物的穩(wěn)定性。

(5)工藝簡單，易于制備與運輸、容易保存。

因此，研制出粒徑20-50nm范圍、具有高度熱力學(xué)穩(wěn)定、且能刺激機體產(chǎn)生高強度的粘膜免疫應(yīng)答納米乳免疫佐劑對疫苗顯得尤為重要。

制備方案

均質(zhì)機的選擇

微射流均質(zhì)屬于高壓均質(zhì)中的一種，在生物工程、輕工化工、食品飲料等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用。微射流均質(zhì)的方法在作用過程中產(chǎn)生的一系列高強度破壞力（湍流力、剪切力以及空穴效應(yīng)）能有效破碎較大顆粒的液滴，進(jìn)而形成較小顆粒的納米乳液，且均質(zhì)條件、表面活性劑組分和濃度的變化都影響乳液粒徑。Roberts等研究發(fā)現(xiàn)微射流均質(zhì)機所具有空腔效應(yīng)可以改變表面活性劑的結(jié)構(gòu)，降低乳液的粒徑大小，進(jìn)而提高體系的穩(wěn)定性，并適用于各類乳液。

由PSI專有技術(shù)研發(fā)的增壓器及均質(zhì)腔，通過調(diào)節(jié)恒定的均質(zhì)壓力并搭配優(yōu)秀的Y、Z型幾何結(jié)構(gòu)微米級金剛石均質(zhì)腔，能夠獲得穩(wěn)定可控的剪切力，從而對工藝流程的穩(wěn)定以及線性放大的保證起到可靠支持。高2069 bar的均質(zhì)壓力搭配低于100μm孔徑的均質(zhì)腔，其產(chǎn)出的高剪切力超過市面上絕大多數(shù)同類型儀器。低至15mL的死體積更利于用作實驗研發(fā)、處理珍貴稀有樣品。有助于研發(fā)、生產(chǎn)過程中優(yōu)化配方以獲得大的穩(wěn)定性，延長貨架期、降低生產(chǎn)成本。

PSI包括PSI-20、PSI-40、PSI-300等從小試到生產(chǎn)多種型號，可滿足不同科研或生產(chǎn)需求。

理化表征：粒徑和Zeta電位

CDE發(fā)布《病毒預(yù)防用疫苗研發(fā)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中指出“如涉及佐劑或新型抗原遞呈系統(tǒng)，應(yīng)結(jié)合其與抗原相互作用的結(jié)構(gòu)或特性開展必要的質(zhì)量研究，理化結(jié)構(gòu)特性如佐劑等電點、粒徑及其分布、與抗原的吸附率等；脂質(zhì)體包封率、粒徑等。”

（1）平均粒徑和尾端大粒子：

粒徑分布檢測經(jīng)典的表征手段，通過粒徑分布可以直觀分析出均質(zhì)機制備后的差異。從而反推配方或工藝，指引研發(fā)?；蛘咄ㄟ^粒徑檢測來確認(rèn)批間差，鑒定設(shè)備運行狀況。

Nicomp Z3000采用DLS和PALS原理，通過對粒徑分布（高斯分布和Nicomp多峰），PI值，Chi卡方值等作為質(zhì)量控制指標(biāo)。

穩(wěn)定性研究一直是制劑里面重要的一項，引起不穩(wěn)定的因素有很多，異常顆粒或者說尾端大顆粒往往受到忽視，雖然乳佐常規(guī)平均粒徑一般在亞微米級別或者納米級別，但是微米的乳粒往往大量存在，而這些尾端大顆粒的存在往往會吸附小顆粒，不斷團(tuán)聚成大顆粒，導(dǎo)致穩(wěn)定性差，甚至出現(xiàn)破乳、油相分離等現(xiàn)象，影響產(chǎn)品質(zhì)量。

AccuSizer A7000APS采用SPOS技術(shù)，可以實現(xiàn)針對500nm以上高濃度樣品進(jìn)行計數(shù)檢測。通過對尾端大顆粒定量分析，輕松幫助客戶找到之前一直困擾客戶的質(zhì)量問題。

（2）Zeta電位：

Zeta電位的檢測往往通過納米粒度儀進(jìn)行檢測，Zeta電位作為穩(wěn)定性的一項參考指標(biāo)。Zeta 電位是通過檢測粒子與液體接觸的擴散層電荷從而反映的是整個體系的穩(wěn)定程度，一般受到PH值，溫度，特殊添加劑（如表面活性劑）等因素影響，一般認(rèn)為當(dāng)絕對值大于30mv，體系較為穩(wěn)定。

Nicomp Z3000采用ELS技術(shù)，通過頻譜分析和PALS分析進(jìn)行Zeta電位檢測。無論是針對水相還是有機相樣品，都可以輕松完成檢測，更進(jìn)一步通過Zeta電位正負(fù)值判定表面修飾，或通過pH調(diào)節(jié)來確定等電點IEP。

圖四 某樣品Zeta電位檢測報告

總結(jié)

奧法美嘉通過PSI微射流均質(zhì)機和PSS粒度儀的Nicomp Z3000、AccuSizer A7000APS提供從初乳均質(zhì)到粒徑分析的全套方案，為制藥企業(yè)從研發(fā)到生產(chǎn)保駕護(hù)航。

• 意大利PSI-40高壓微射流均質(zhì)機

  前處理設(shè)備在線詢價