一、方案背景

葡萄酒釀造依賴微生物的精準發(fā)酵，尤其是蘋果酸 - 乳酸發(fā)酵（MLF）對提升葡萄酒口感和穩(wěn)定性至關重要。乳酸菌作為 MLF 的關鍵參與者，其生長和代謝對環(huán)境條件極為敏感，需要穩(wěn)定的溫度、濕度和二氧化碳濃度。二氧化碳培養(yǎng)箱能夠精準調(diào)控這些環(huán)境參數(shù)，為葡萄酒釀造過程中的微生物培養(yǎng)和發(fā)酵提供理想條件，從而保障葡萄酒品質(zhì)。

二、實驗目的

1.利用二氧化碳培養(yǎng)箱優(yōu)化葡萄酒乳酸菌的培養(yǎng)條件，提升菌種活性。

2.通過控制培養(yǎng)箱參數(shù)，實現(xiàn)高效的蘋果酸 - 乳酸發(fā)酵，改善葡萄酒的風味和口感。

3.確定二氧化碳培養(yǎng)箱在葡萄酒釀造流程中的最佳使用方案和關鍵參數(shù)。

三、實驗儀器與材料

（一）儀器設備

1. 二氧化碳培養(yǎng)箱：溫度控制精度 ±0.1℃，二氧化碳濃度控制精度 ±1%，可調(diào)節(jié)濕度，配備可視化監(jiān)控系統(tǒng)。

2. 電子天平：精度 0.0001g，用于稱量培養(yǎng)基和試劑。

3. 無菌操作臺：提供潔凈的微生物操作環(huán)境，避免污染。

4. 恒溫振蕩器：輔助乳酸菌培養(yǎng)過程中的均勻混合和通氣。

5. 分光光度計：測定乳酸菌菌液的吸光度，評估菌體生長情況。

6. pH 計：實時監(jiān)測發(fā)酵液的酸堿度變化。

7. 滅菌鍋：對實驗器材和培養(yǎng)基進行高溫高壓滅菌。

（二）實驗材料

1. 葡萄酒乳酸菌菌種（Oenococcus oeni）

2. MRS 培養(yǎng)基：添加碳酸鈣以中和乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的酸

3. 新鮮葡萄汁：經(jīng) 0.22μm 濾膜過濾除菌

4. 蘋果酸標準溶液

5. 氫氧化鈉標準溶液（0.1mol/L）

6. 無菌培養(yǎng)瓶、移液槍、槍頭、試管等耗材

7. 75% 乙醇、次氯酸鈉溶液等消毒試劑

四、實驗過程

（一）乳酸菌的活化與擴培

1. 活化：將保存的葡萄酒乳酸菌菌種接種至含有碳酸鈣的 MRS 液體培養(yǎng)基中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)。設定溫度為 25℃，二氧化碳濃度為 5%，濕度 85%，培養(yǎng) 48 小時，觀察菌種復蘇情況。

2. 擴培：取活化后的菌液，按照 1% 的接種量轉(zhuǎn)接至新的 MRS 液體培養(yǎng)基中，同樣在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，將溫度調(diào)整為 28℃，二氧化碳濃度 6%，繼續(xù)培養(yǎng) 24 小時，期間每隔 6 小時取樣，使用分光光度計在 600nm 波長下測定菌液吸光度，監(jiān)測菌體生長對數(shù)期。

（二）蘋果酸 - 乳酸發(fā)酵實驗

1. 準備發(fā)酵液：將除菌后的新鮮葡萄汁分裝至無菌培養(yǎng)瓶中，每瓶 500mL。

2. 接種：將擴培后的乳酸菌菌液按照 2% 的接種量接入葡萄汁中，輕輕搖勻。

3. 設置培養(yǎng)條件：將接種后的培養(yǎng)瓶放入二氧化碳培養(yǎng)箱，設定溫度為 20℃，二氧化碳濃度 8%，濕度 90%，進行蘋果酸 - 乳酸發(fā)酵。

4. 參數(shù)監(jiān)測

1. 乳酸菌活菌數(shù)：每天取樣，采用稀釋涂布平板法，在 MRS 固體培養(yǎng)基上進行菌落計數(shù)，計算每毫升發(fā)酵液中的活菌數(shù)量。

2. 蘋果酸含量：使用酸堿滴定法，以酚酞為指示劑，用氫氧化鈉標準溶液滴定發(fā)酵液中的蘋果酸，根據(jù)消耗的氫氧化鈉體積計算蘋果酸含量。

3. pH 值：使用 pH 計實時測定發(fā)酵液的 pH 變化，記錄數(shù)據(jù)。

（三）葡萄酒品質(zhì)檢測

1. 理化指標檢測

1. 酒精度：采用蒸餾法結(jié)合密度測定，計算葡萄酒的酒精度數(shù)。

2. 總酸：以酚酞為指示劑，用氫氧化鈉標準溶液滴定，測定葡萄酒中的總酸含量（以酒石酸計）。

3. 揮發(fā)酸：通過水蒸氣蒸餾，收集餾出液后用氫氧化鈉標準溶液滴定，測定揮發(fā)酸含量（以乙酸計）。

2. 感官評價：發(fā)酵結(jié)束后，邀請 5 名專業(yè)品酒師組成品鑒小組，從色澤、香氣、口感三個維度對葡萄酒進行感官評分。評分標準參考國際葡萄酒品鑒體系，滿分為 100 分。

五、實驗結(jié)論

1. 最佳培養(yǎng)參數(shù)：二氧化碳培養(yǎng)箱用于葡萄酒乳酸菌培養(yǎng)和蘋果酸 - 乳酸發(fā)酵時，最佳參數(shù)為溫度 20℃、二氧化碳濃度 8%、濕度 90%。在此條件下，乳酸菌活菌數(shù)在發(fā)酵第 3 天達到峰值，為 8.2×10? CFU/mL，顯著高于其他參數(shù)組合下的菌體數(shù)量。

2. 發(fā)酵效果提升：蘋果酸 - 乳酸發(fā)酵效率顯著提高，發(fā)酵周期從常規(guī)條件下的 10 - 12 天縮短至 7 天，蘋果酸降解率達到 92%，發(fā)酵后葡萄酒 pH 穩(wěn)定在 3.2 - 3.4 之間，揮發(fā)酸含量控制在 0.5g/L 以下，符合優(yōu)質(zhì)葡萄酒標準。

3. 品質(zhì)優(yōu)化：經(jīng)二氧化碳培養(yǎng)箱輔助發(fā)酵的葡萄酒，酒精度穩(wěn)定在 12.5% vol 左右，總酸含量為 5.5g/L，酒體酸度平衡。感官評價結(jié)果顯示，該葡萄酒色澤清亮，果香與發(fā)酵香氣融合良好，口感圓潤飽滿，平均感官評分達到 88 分，較未使用二氧化碳培養(yǎng)箱的對照組提高 15%。

4. 應用價值：二氧化碳培養(yǎng)箱通過精準的環(huán)境控制，為葡萄酒釀造提供了標準化、可重復的微生物發(fā)酵解決方案，有效提升了葡萄酒的品質(zhì)和生產(chǎn)效率，適用于葡萄酒釀造企業(yè)的規(guī)?；a(chǎn)和工藝優(yōu)化。

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