Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法是用來(lái)定量檢測(cè)二次感染登革熱病毒（1~4型）IgG抗體的方法?？梢宰鳛樵\斷二次感染登革熱的臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)輔助手段，能與登革熱IgM捕獲ELISA法聯(lián)合應(yīng)用來(lái)鑒別初次感染或是二次感染。這個(gè)方法僅能用來(lái)檢測(cè)具有臨床登革熱癥狀的病人的樣本。陽(yáng)性結(jié)果必須經(jīng)病毒分離、雙份血清分析、免疫組織化學(xué)檢測(cè)抗原或病毒核酸檢測(cè)證實(shí)有登革熱病毒感染。

       登革熱病毒是一種黃病毒屬，廣泛存在于熱帶和亞熱帶地區(qū)。世界上一半人口生活在這些地區(qū)，處在登革熱傳染的危險(xiǎn)之下。就其引起人類的發(fā)病率和死亡率來(lái)論，登革熱已成為zui重要節(jié)肢動(dòng)物疾病。有4種不同的、但在抗原學(xué)上相關(guān)的登革熱病毒類型。它通過(guò)雌性蚊子，特別是埃及伊蚊、白紋伊蚊和波利尼西亞伊蚊來(lái)傳播。

登革熱病毒感染的臨床表現(xiàn)多種多樣，從亞臨床癥狀到死亡。根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度可以分級(jí)如下：非特異性熱性疾病、典型的登革熱、登革出血熱（DHF）（I級(jí)和II級(jí)）和登革休克綜合癥（III 級(jí)和IV級(jí)）。典型的登革熱表現(xiàn)為突然發(fā)熱伴隨著兩種或更多種的癥狀：頭痛、后眼眶痛、肌痛、關(guān)節(jié)痛、出疹、出血表現(xiàn)以及白細(xì)胞減少癥。雙相熱型、失眠和由于味覺(jué)喪失或苦味引起的食欲不振都很常見(jiàn)。DHF和DSS很嚴(yán)重，是經(jīng)常伴隨著第二種血清型感染而出現(xiàn)的可能會(huì)致死的并發(fā)癥。

在登革熱流行的那些國(guó)家，大多數(shù)病人會(huì)有二次感染?？贵w的檢測(cè)有助于診斷，特別是二次和繼后的感染，那時(shí)并發(fā)癥的發(fā)生率很高。一般地，血凝反應(yīng)-抑制（HAI）滴度用來(lái)分類初次感染或是二次感染。目前結(jié)果的確定依賴于至少7天內(nèi)及時(shí)分離得來(lái)的配對(duì)血清樣本的分析，HAI滴度≥ 1:2560的急性樣本確定為來(lái)自第二次黃病毒屬感染的病人。然而，根據(jù)HAI分類登革熱病例的普遍適用性由于血凝素在不同實(shí)驗(yàn)室的可變性而受到了質(zhì)疑。

Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法是一種替代HAI分析登革熱二次感染血清學(xué)診斷的有效方法，因?yàn)樗ㄟ^(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)減少了登革熱血清在實(shí)驗(yàn)室間的變異。不像HAI，不需要用丙酮萃取血清，如果得到了陽(yáng)性結(jié)果，血清也無(wú)須出院后獲得。登革熱二次感染表現(xiàn)為感染發(fā)作后1~2天出現(xiàn)可檢測(cè)的高IgG水平，這可能伴隨有IgM水平的升高。高IgG水平（>22Panbio單位）因此作為登革熱病毒二次感染的標(biāo)志。

 

      血清IgG抗體和包埋在微孔板測(cè)試帶（測(cè)定板）聚苯乙烯表面的抗-人IgG抗體相結(jié)合。在每個(gè)含有登革熱病毒抗原（1~4型）的抗原瓶中加入抗原重組緩沖液。在重組抗原中加入相同體積的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）-結(jié)合單克隆抗體（MAb）,形成抗原-Mab復(fù)合物。沖洗走測(cè)定板上的殘存血清，加入復(fù)合的抗原-Mab。然后抗原-Mab復(fù)合物和血清登革熱-特定IgG抗體結(jié)合。孵育后，沖洗微孔板，再加入無(wú)色底物，四甲基聯(lián)苯胺/過(guò)氧化氫TMB/H2O2。底物被HRP水解，如果有的話，那色原體就會(huì)變成藍(lán)色。用酸終止反應(yīng)后，TMB變成黃色。顏色的變化是測(cè)試樣本中存在抗-登革熱IgG抗體的標(biāo)志。

 

     1．抗-人IgG-包埋的微孔板-（綠色的測(cè)定板）（12＊8個(gè)孔）。備用。沒(méi)有用過(guò)的微孔應(yīng)立即重新密封好，貯存在有干燥劑的地方。在2-8ºC穩(wěn)定至失效。

     2．裝在瓶中的穩(wěn)定的登革熱抗原-1、2、3、4型登革熱病毒抗原凍干在小瓶中。沒(méi)有用過(guò)的凍干的抗原應(yīng)該貯存在2-8ºC。重組抗原能冷凍保存和解凍一次。凍干抗原在2-8ºC穩(wěn)定至失效。

     3．洗滌緩沖濃縮液-一瓶60ml裝，吐溫20和防腐劑（0.1% ProclinTM）20倍濃縮的磷酸鹽緩沖鹽水pH 7.2-7.6。[在低溫下可能會(huì)形成結(jié)晶。為避免這種情況，把它放在37度直至變得透明。充分混勻。]在1份洗滌緩沖濃縮液加入19份蒸餾水稀釋。稀釋的緩沖液在2~25ºC可以貯存一個(gè)星期。

     4．血清稀釋液-兩瓶50ml裝（粉紅色）。備用。三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水pH 7.2-7.6 含防腐劑（0.1% Proclin）和添加劑。在2~8度保持穩(wěn)定直至失效。

     5．抗原重組緩沖液-一瓶7ml裝（透明色）。備用。緩沖液含有防腐劑（0.1% Proclin）和蛋白穩(wěn)定劑。在2~8ºC保持穩(wěn)定直至失效。

     6．辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合單克隆抗體示蹤劑-一瓶7ml裝（綠色）。備用。辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合單克隆抗體示蹤劑含防腐劑（0.1% Proclin.）和蛋白穩(wěn)定劑。在2~8ºC保持穩(wěn)定直至失效。

     7．四甲基聯(lián)苯胺 TMB-一瓶15ml裝。備用。3,3,5,5''''-TMB和枸酸鹽緩沖液（pH 3.5-3.8）內(nèi)的過(guò)氧化氫的混合物。在2~8ºC保持穩(wěn)定直至失效。

     8．IgG反應(yīng)對(duì)照血清-一個(gè)紅色有蓋的瓶子裝有200µL人血清（含有0.1%疊氮化納和0.005%硫酸慶大霉素）。在2~8ºC保持穩(wěn)定直至失效。

     9．IgG標(biāo)準(zhǔn)血清-一個(gè)黃色有蓋瓶子裝有400µL人血清（內(nèi)含0.1%疊氮化納和0.005%硫酸慶大霉素）。在2~8ºC保持穩(wěn)定直至失效。

     10．IgG陰性對(duì)照血清-一個(gè)綠色有蓋的瓶子裝有200µL人血清（含有0.1%疊氮化納和0.005%硫酸慶大霉素）。在2~8ºC保持穩(wěn)定直至失效。

     11．終止液-一個(gè)瓶子15ml裝。備用。1M磷酸。在2~25ºC保持穩(wěn)定直至失效。

 

      Proclin. 300是RohmHaas公司的注冊(cè)商標(biāo)產(chǎn)品

 

 

預(yù)警：

      在這些成份里疊氮化納的濃度是有毒性的，是屬于下列級(jí)別R22, R32的：“吞食有毒"和“和酸接觸會(huì)釋放出有毒氣體"

另外必需具備但不提供的材料：

1．精確可調(diào)節(jié)微量移液器（5-1000µL容量），配備一次性使用吸管

2．去離子水

3．微量培養(yǎng)板洗滌系統(tǒng)

4．酶標(biāo)儀配備450nm濾波片

5．計(jì)時(shí)器

6．刻度量筒

7．燒瓶

8．血清稀釋用的試管或微量滴定板

 

警示: 用于體外診斷用

i 用在準(zhǔn)備對(duì)照時(shí)的所有人類來(lái)源的材料在測(cè)試對(duì)人類缺陷性病毒1和2（HIV1和2）、丙型肝炎病毒以及乙型肝炎病毒表面抗原抗體時(shí)，都為陰性。但是沒(méi)有哪種方法能夠*保證，所以所有的人體對(duì)照和抗原都應(yīng)該認(rèn)為是潛在的感染源。疾病預(yù)防控制中心和國(guó)家健康署建議可能傳染的抗原應(yīng)該在2級(jí)生物安全下進(jìn)行處理。

ii 這種測(cè)試只能用血清。用全血、血漿或是其它的樣本間質(zhì)不能做。

iii 黃疸的或黃體脂蛋白血清，或表現(xiàn)出溶血的，或有細(xì)菌生長(zhǎng)的血清都不可用。

iv 不要加熱失活的血清。

v 在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，所有的試劑必須要平衡至室溫（20~25ºC）。試驗(yàn)受到室溫變化的影響。只有達(dá)到了室溫才能把微孔板從密封包里拿出來(lái)。

vi 用干凈的槍頭直接在瓶子里配試劑。轉(zhuǎn)移試劑可能會(huì)導(dǎo)致污染。

vii 未用過(guò)的微孔板，應(yīng)立即重新封存，并儲(chǔ)存有干燥劑的地方。如果不這樣做可能會(huì)造成錯(cuò)誤的結(jié)果。

viii 底物系統(tǒng)

a 由于TMB易受金屬離子污染影響,所以不允許底物系統(tǒng)和金屬表面接觸。

b 避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于陽(yáng)光直射下。

c 一些洗滌劑可能會(huì)干擾TMB的表現(xiàn)。

d TMB可能會(huì)有一些淡藍(lán)色。這個(gè)不會(huì)影響底物的活性或者試驗(yàn)的結(jié)果.

警告

ix 這些試劑盒成份內(nèi)含有*，它可能與鉛或銅管道反應(yīng)形成高爆炸性金屬疊氮化合物。當(dāng)通過(guò)水管裝置來(lái)去除這些試劑時(shí)，用大量的水沖洗以防止疊氮積聚在排水管。

x *會(huì)抑制結(jié)合物的活性。必須用干凈的移液管槍頭來(lái)加結(jié)合物以致*不會(huì)被其它試劑攜帶污染。

為獲得更多的安全信息請(qǐng)參照從PANBI0得到的原料安全數(shù)據(jù)表（MSDS）.

標(biāo)本收集和準(zhǔn)備

讓靜脈血在室溫下（20~25ºC）凝結(jié)成塊，然后根據(jù)全國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)NCCLS（收集診斷靜脈血的認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)程序，H3-A4, 1998）進(jìn)行離心。

血清應(yīng)盡快分離并冷藏（2~8ºC），如果在兩天內(nèi)不試驗(yàn)的話，就應(yīng)該冷凍（-20ºC或更低的溫度）。不推薦使用自我解凍的致冷機(jī)。黃疸血清、有溶血的、脂血的或是有細(xì)菌生長(zhǎng)的血清都不推薦使用。CLSI提供貯存血樣的建議。（血樣處理加工的認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)程序，H18-A2, 1999）。

 

 

測(cè)試程序：

  注意：確保在實(shí)驗(yàn)前，所有的試劑都平衡至室溫（20~25ºC）。在超出所提供的時(shí)間和溫度范圍內(nèi)試驗(yàn)可能會(huì)導(dǎo)致無(wú)效的結(jié)果。沒(méi)有在即定的時(shí)間和溫度內(nèi)進(jìn)行的試驗(yàn)應(yīng)重復(fù)一次。

 

血清預(yù)稀釋：

i 從箔袋內(nèi)拿出所需數(shù)量的微孔板，并插入夾板固定器。5個(gè)板分別是陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物。確保剩下未用的微孔板緊緊地密封在箔袋內(nèi)。

ii 用合適的試管或微量滴定板稀釋陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)物和病人樣品。

a 在10µL血清中加入1000µL血清稀釋液。充分混勻。或者

b 在10µL血清中加入90µL血清稀釋液。取出20µL稀釋的血清加入180µL血清稀釋液。充分混勻。

 

EELISA操作步驟：

對(duì)方法的概括參見(jiàn)附圖

a    穩(wěn)定的抗原瓶。

i                 從試劑盒內(nèi)取出所需的凍干抗原瓶。每瓶可足夠2條帶16個(gè)孔使用。在每瓶?jī)?nèi)各加入1ml的抗原重組緩沖液?；靹虼_保抗原溶解。如果完好的重組抗原沒(méi)有用過(guò)，將它保存在-80ºC直至所需。確保剩下沒(méi)用的重組抗原貯存在2~8ºC。

ii               取出所需量的重組抗原，然后在一個(gè)干凈的玻璃或塑料瓶里混合相同體積的MAb 示蹤劑。輕輕地混勻抗原和MAb示蹤劑溶液，再在室溫下保持至所需時(shí)。為測(cè)試板總量微孔準(zhǔn)備足夠的抗原瓶，也即每瓶抗原可夠16個(gè)孔（2條帶）使用。

b    測(cè)試板

i                 混勻后10分鐘內(nèi)，吸取100µL稀釋的病人樣本和對(duì)照，分別加入測(cè)試板相應(yīng)的微孔內(nèi)。

ii               蓋上測(cè)試板，在37°C±1°C孵育1小時(shí)。

iii             用稀釋的洗滌緩沖液沖洗6次。（參見(jiàn)下面的沖洗步驟）。

iv              混勻抗原和MAb示蹤劑。吸取100 µL混勻物，加入測(cè)試板相應(yīng)的孔內(nèi)。

v                蓋上測(cè)試板，在37°C±1°C孵育1小時(shí)。

vi              用稀釋的洗滌緩沖液沖洗6次。（參見(jiàn)下面的沖洗步驟）。

vii            在每個(gè)孔內(nèi)加入100 µL TMB。

viii          從*次加入算起，在室溫下20-25°C 孵育10分鐘。將會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色。

ix              按TMB加入的時(shí)間和順序，在所有的孔內(nèi)加入100 µL終止液?；靹?。藍(lán)色將會(huì)變成黃色。

x                30分鐘內(nèi)讀數(shù)，波長(zhǎng)450nm，參照濾波器600~650nm。

注意：如果是雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)，在600~650nm間設(shè)定參照濾波。如果在450nm讀數(shù)沒(méi)有參照濾波時(shí)，可能會(huì)由于背景因素出現(xiàn)更高的吸光值。

 

 

 

有效的沖洗能去除沒(méi)有混合的樣品或成分，這對(duì)于ELISA程序是很有必要。

A．全自動(dòng)沖洗板

1 吸光所有孔內(nèi)容物。

2 在沖洗過(guò)程中，洗滌緩沖液要注滿孔（350 µL）

3 6次沖洗完后，把板翻轉(zhuǎn)，在吸水紙上用力敲打確保去除所有的沖洗緩沖液。

4 全自動(dòng)沖洗板一定要維護(hù)好，確保沖洗效果。在所有時(shí)間內(nèi)都要遵照制造商的沖洗說(shuō)明。

B. 人工沖洗

1 把內(nèi)容物倒入合適的廢物缸。

2 用一個(gè)合適的擠壓瓶把洗滌緩沖液加滿孔，避免起泡，因?yàn)檫@可能會(huì)降低沖洗效果。立即倒掉緩沖液。

3 重新加滿，再立即倒掉。

4 再重復(fù)4次步驟3?？偣灿孟礈炀彌_液洗6次。

5 洗完zui后一次后，倒掉孔內(nèi)容物，把板翻轉(zhuǎn)，在吸水紙上用力敲打確保去除所有的沖洗緩沖液。

 

  每個(gè)試劑盒包括標(biāo)準(zhǔn)物，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照血清。在隨附的說(shuō)明表列有這些血清合適值。那陰性和陽(yáng)性對(duì)照是用來(lái)監(jiān)測(cè)由試劑引起的失敗。陽(yáng)性對(duì)照不能確保試驗(yàn)臨界點(diǎn)的精確度。如果對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值沒(méi)有達(dá)到說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)，則測(cè)試無(wú)效，就應(yīng)該重做。如果測(cè)試無(wú)效，病人結(jié)果就不能報(bào)告。質(zhì)量控制需要必須遵照當(dāng)?shù)氐?、州?或國(guó)家法律或委任書(shū)和你們實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量程序。

建議用戶參照NCLSI C24-A和42 CFR 493.1202c中的合適的質(zhì)量控制實(shí)踐指導(dǎo)。

 

1 計(jì)算三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物的平均吸光度值。這是臨界值。

2 樣品的吸光度除以臨界值就得到指數(shù)值。

或者

3 指數(shù)值乘以10就得到Panbio 單位。

指數(shù)值=樣品的吸光度/臨界值

例如：樣品A的吸光度=0.949

樣品B的吸光度=0.070

臨界值=0.302

樣品A 0.949/0.302=3.14指數(shù)值

樣品B 0.070/0.302=0.23指數(shù)值

Panbio 單位=指數(shù)值 X 10

樣品A 3.14 X 10 = 31.4 Panbio 單位

樣品B 0.23 X 10 = 2.3 Panbio 單位

 

 

結(jié)果解釋：

  登革熱IgG捕獲ELISA法檢定二次登革熱病毒感染病人血清中IgG抗體水平。陽(yáng)性結(jié)果（> 22 Panbio 單位）表明急性二次登革熱感染。如果要區(qū)分是初次還是二次感染，就應(yīng)該用到登革熱Duo ELISA法。

解釋

 

結(jié)果解釋

 

  推薦一種報(bào)道結(jié)果的方法：由Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法得出下列結(jié)果。不同方法得出的結(jié)果不能互換。測(cè)量結(jié)果超出臨界值不表示現(xiàn)有抗體總量。結(jié)果應(yīng)該報(bào)告為陽(yáng)性、陰性或可疑，而不能報(bào)數(shù)值。

 

1．臨床診斷必須根據(jù)臨床癥狀和病人體征來(lái)解釋。從試劑得來(lái)的結(jié)果不是診斷性的。應(yīng)該結(jié)合臨床數(shù)據(jù)和病人癥狀來(lái)考慮。

2．在不同的地理區(qū)域，人群血清流行病學(xué)可能會(huì)隨著時(shí)間的改變而變化。因此，那臨界值可能需要根據(jù)當(dāng)?shù)氐难芯窟M(jìn)行調(diào)整。

3．不能用來(lái)做一般人群的篩查。陽(yáng)性預(yù)值依賴于現(xiàn)存在病毒的可能性。只能對(duì)有臨床癥狀的病人進(jìn)行測(cè)試，或者有可疑暴露時(shí)。

4．和黃病毒屬出現(xiàn)血清學(xué)交叉反應(yīng)是常見(jiàn)的事（即在登革熱1，2，3，4型和日本腦炎、墨累山谷腦炎、圣路易腦炎、黃熱病、西尼羅河病毒等之間）。在確診前必須排除這些疾病。在做登革熱IgG捕獲ELISA法的臨床試驗(yàn)中，我們觀察到IgG水平之間也存在交叉反應(yīng)，在其它組也有類似的發(fā)現(xiàn)。

5．免疫測(cè)定中的嗜異染抗體是一種很好識(shí)別的干擾原因。這些動(dòng)物IgG抗體可能會(huì)與試劑IgG抗體交叉反應(yīng)并產(chǎn)生假陽(yáng)性。這在確診前也必須被排除。

6．沒(méi)有為可視的結(jié)果確定建立表現(xiàn)特征。

7．這個(gè)測(cè)定利用昆蟲(chóng)表達(dá)蛋白。人類抗-昆蟲(chóng)抗體的交叉反應(yīng)或干擾對(duì)測(cè)定結(jié)果來(lái)說(shuō)是不可知的。

8．根據(jù)Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法，所有的血清都顯示為一個(gè)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，這時(shí)應(yīng)該送交參照實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確定和流行病學(xué)記錄。

 

 登革熱二次感染表現(xiàn)為在感染發(fā)作后的1~2天特異性IgG水平很高，而且大多數(shù)病例還伴有IgM水平的升高。

在一些二次感染中，可檢測(cè)到的IgG抗體水平可能是低的。一些病人在感染后的頭7~10天可能不會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)到水平的抗體。只要癥狀還存在，我們就建議在*份樣本后的4~7天對(duì)病人重新進(jìn)行測(cè)試。

 

 在馬來(lái)群島的一所大學(xué)里，我們用Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法對(duì)血凝抑制和內(nèi)部ELISA法標(biāo)記的146份回顧性血清進(jìn)行了測(cè)試。這些血清包括30份地方性的血清陰性樣本，60份表現(xiàn)為初次登革熱感染陽(yáng)性的血清樣本和56份表現(xiàn)為二次登革熱感染陽(yáng)性的樣本。結(jié)果用來(lái)測(cè)定該方法的靈敏性，特異性和*性。數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

 

表1 Panbio ELISA血清學(xué)靈敏性和特異性與登革熱疾病狀況的比較

Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法

＊可疑樣本的重測(cè)試沒(méi)有計(jì)算在內(nèi)。

                                               95% CI＊

血清學(xué)靈敏性（二次感染）b =48/56  = 85.7%    73.8 – 93.6%

血清學(xué)特異性（初次感染）b = 56/60  = 93.3%   83.8 – 98.2%

血清學(xué)特異性（血清陰性）  = 30/30  = 100.0%  88.4 – 100.0%

血清學(xué)*性b             =134/146  = 91.8%  86.1 – 95.7%

a 樣品經(jīng)HAI法（滴度≥2560）檢測(cè)為二次登革熱感染陽(yáng)性。

b可疑數(shù)不包括可疑樣本的重測(cè)試。（見(jiàn)上＊）

＊CI=可疑區(qū)間

 

 為了測(cè)定Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法試劑盒的重現(xiàn)性，我們用3個(gè)批號(hào)的試劑盒在不同的3天對(duì)8份血清每份進(jìn)行了3次測(cè)試。用方差分析對(duì)組內(nèi)、日間、組間和總的精密度進(jìn)行了分析。結(jié)果見(jiàn)表2。

 

 

 

 

 

 

 

表2 Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法精密度測(cè)定（用指數(shù)值＊）

所有的值都是從指數(shù)值計(jì)算得來(lái)的

SD=標(biāo)準(zhǔn)差； CV=變異系數(shù)

注意：由于列表原因，標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果保留兩位小數(shù)

＊樣品吸光度除以臨界值得到指數(shù)值。

 

 通過(guò)測(cè)試一組66份來(lái)自其它確診病人（非登革熱）的樣品來(lái)測(cè)定Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法的診斷特異性。那樣品來(lái)自于患有可能存在交叉反應(yīng)疾病的病人。測(cè)試中的每份樣品的Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法分析都要服從于其疾病診斷。結(jié)果參見(jiàn)表3。

 

表3 Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法-交叉反應(yīng)分析

 

 

 

 

 

 

1. Mairuhu, A. T. A., Wagenaar, J., Brandjes, D. P. M.van Gorp, E. C. M. 2004. Dengue: an arthropod-borne disease of global importance. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.236:425-33.

2. Kuhn, R. J., Zhang, W., Rossmann, M. G., Pletnev, S. V.,Corver, J., Lenches, E., Jones, C.T., Mukhopadhyay, S.,Chipman, P. R., Strauss, E. G., Baker, T. S.Strauss, J. H.2002. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation,fusion. Cell. 108:717-725.

3. Innis, B. L., Nisalak, A., Nimmannitya, S., Kusalerdchariya, S.,Chongswasdi, V., Suntayakorn, S., Puttisri, P.Hoke, C.H. 1989. An enzyme-linked immunosorbent assay to characterize dengue infections where dengueJapanese encephalitis co-circulate. Am J Trop Med Hyg. 404: 418-427.

4. Sutherst R. W. 1993. Arthropods as Disease Vectors in a Changing Environment in Environmental ChangeHuman Health. Ciba Foundation Symposia 175: John WileySons Ltd, United Kingdom.

5. Hawkes, R. A., Boughton, C. R., Naim, H. M., Wild, J.Chapman, B. 1985. Arbovirus infections of humans in New South Wales. Seroepidemiology of the flavivirus group of togaviruses. Med J Aust, 143 12-13: 555-561.

6. Chen W., Hwang K.Fang A. 1991. Detection of IgM antibodies from cerebrospinal fluidsera of dengue fever patients. Southeast Asian J of Trop Med Public Health. 224: 659 - 663.

7. James, P. 1992. UseInterpretation of Tests in Medical Microbiology. Specialty Laboratories Inc, USA.

8. Technical advisory group on dengue haemorrhagic fever/dengue shock syndrome, 1986. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatmentcontrol. Geneva, Switzerland: World Health Organisation.

9. CDC-NIH Manual. 1999. Biosafety in MicrobiologicalBiomedical Laboratories. 4th ed. pp.9-12. U.S. Dept. of HealthHuman Services, Public Health Service.

10. Ruechusatawat, K., Morita, K., Tanaka, M., Vongcheree, S., Rojanasuphot, S., Warachit, P., Kanai, K., Thongtradol, P., Nimnakorn, P., Kanungkid, S.Igarashi, A. 1994. Daily observation of antibody levels among dengue patients detected by enzyme-linked immunosorbent assay ELISA.Jap. J. Trop. Med. Hyg 22: 9.

11. Makino, Y., Tadano, M., Saito, M., Maneekarn, N.,Sittisombut, N., Sirisanthana, V., Poneprasert, B.Fukunaga, T. 1994. Studies on serological cross-reaction in sequential flavivirus infections. Microbiol. Immunol. 38: 951-955.

12. Murray, P. R., Baron, E. J., Pfaller, M. A., Tenover, F. C. and

Yolken, R. H. eds 1999. Manual of Clinical Microbiology, 7th

Edition, p. 205. ASM Press, Washington, D. C.