【試劑盒簡介】

禽流感病毒H9亞型（AIV-H9）RT-PCR 檢測試劑盒，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR ）技術(shù)檢測禽組織、分泌物和排泄物中的AIV-H9，適用于AIV-H9的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

【試劑盒原理】

利用吸附柱提取RNA作為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以引物為起點合成與RNA 模板互補的cDNA鏈；然后在DNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán)，使特異DNA 片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬倍。將擴增的DNA 片段進行電泳、染色后，在紫外燈下，肉眼可見DNA 片段的擴增帶。 

【試劑盒組份】

【試劑盒保存條件及有效期】

1. 大盒請保存于室溫，小盒請保存于-20℃。

2. 有效期為半年。 

【需自備的材料】

生理鹽水、組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC ）處理的滅菌1.5mL 離心管和吸頭、瓊脂糖、TAE電泳液、染色液。

【注意事項】

1．各試劑請在規(guī)定的溫度儲存。

2．本試劑盒有效期為6個月，不要使用超過有效期的試劑。

3. 反復(fù)凍融試劑將降低檢測的靈敏度，建議3次內(nèi)用完。

4．請嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，移液、定時等全部過程必須精確。

5. 保存于-20℃的試劑使用前請*融化，并瞬離15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立即放回-20℃。

6．注意防止試劑盒組分受污染，試劑盒之間的組分不要混用。

7．RNA提取過程中，請戴口罩、勤換手套，盡量縮短操作時間。

【操作方法】

一、樣品制備

1 樣品采集：病死或撲殺的禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于50%甘油生理鹽水中，2～8 ℃保存。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。） 

2 樣品處理： 

2.1 組織樣品的處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物；然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5 mL滅菌離心管中，8000 rpm離心2 min，取200 µL上清于1.5 mL 滅菌離心管中。

2.2 全血樣品的處理：待血凝后取200 µL血清于1.5 mL 滅菌離心管中。

2.3 陽性對照的處理：混勻后，取100 µL于1.5 mL 滅菌離心管中。

2.4 陰性對照的處理：混勻后，取100 µL于1.5 mL 滅菌離心管中。

二、病毒RNA的提取

1. 往裂解液中加入77.6µL BME，充分混勻。（加入了BME的裂解液請放4℃保存）

2. 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入600µL裂解液，充分顛倒混勻，室溫靜置10min 。

3. 加入600µL異丙醇，顛倒混勻。

4. 吸取650μL混合液轉(zhuǎn)入吸附柱中，12,000 rpm 離心45s，棄去收集管中液體，套回收集管。

5. 重復(fù)步驟4。

6. 向吸附柱中加入600µL洗滌液，12,000 rpm 離心45s，棄去收集管中液體，套回收集管。 

7. 重復(fù)步驟6。

8. 空柱12,000 rpm 離心2 min。 

9. 將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5 mL離心管中，在膜*加入25µL洗脫液，室溫靜置1min，12,000 rpm 離心45s，獲得總RNA。 

三、RT-PCR

1. 反應(yīng)體系配制：每份總體積20 µL，分別取16.8µL RT-PCR反應(yīng)液A（用前混勻）、1.2µL RT-PCR反應(yīng)液B和2µL模板RNA（陽性對照管加入1µL陽性對照RNA和1µL陽性模板添加液），混勻。

2. 反應(yīng)程序：在PCR儀上運行以下程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min ；95 ℃ 30 s 、50℃ 40 s 、72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

四、電泳

1. 配制1.5%瓊脂糖凝膠。（請自備TAE電泳液、瓊脂糖和染色液。）

2. 向PCR產(chǎn)物中加入上樣緩沖液，混勻，取10μL混合物點樣于凝膠孔中，以5V/cm的電壓進行電泳。

3. 當(dāng)溴酚蘭電泳至凝膠中下部時結(jié)束電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

【結(jié)果判斷】

    陽性對照出現(xiàn)488bp擴增帶，陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時，實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)488bp擴增帶為禽流感病毒H9亞型陽性，否則為陰性。