【試劑盒簡(jiǎn)介】

禽流感病毒H5亞型（AIV-H5）RT-PCR 檢測(cè)試劑盒，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR ）技術(shù)檢測(cè)禽組織、分泌物和排泄物中的AIV-H5，適用于AIV-H5的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

【試劑盒原理】

利用吸附柱提取RNA作為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以引物為起點(diǎn)合成與RNA 模板互補(bǔ)的cDNA鏈；然后在DNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán)，使特異DNA 片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬倍。將擴(kuò)增的DNA 片段進(jìn)行電泳、染色后，在紫外燈下，肉眼可見DNA 片段的擴(kuò)增帶。 

【試劑盒組份】

大盒 （室溫保存）	1. 裂解液	8mL	5. 洗脫液	500μL
	2. BME	85μL	6. 陰性對(duì)照	350μL
	3. 異丙醇	8mL	8. 吸附柱和收集管	12套
	4. 洗滌液	15mL	9. 0.2 mL 薄壁PCR 管	15個(gè)
小盒 （-20℃保存）	7. 陽性對(duì)照	350μL	10. RT-PCR 反應(yīng)液A	200μL
	11. RT-PCR 反應(yīng)液B	15μL	12. 陽性模板添加液	5μL

【試劑盒保存條件及有效期】

1. 大盒請(qǐng)保存于室溫，小盒請(qǐng)保存于-20℃。

2. 有效期為半年。 

【需自備的材料】

生理鹽水、組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC ）處理的滅菌1.5mL 離心管和吸頭、瓊脂糖、TAE電泳液、染色液。

【注意事項(xiàng)】

1．各試劑請(qǐng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存。

2．本試劑盒有效期為6個(gè)月，不要使用超過有效期的試劑。

3. 反復(fù)凍融試劑將降低檢測(cè)的靈敏度，建議3次內(nèi)用完。

4．請(qǐng)嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，移液、定時(shí)等全部過程必須精確。

5. 保存于-20℃的試劑使用前請(qǐng)*融化，并瞬離15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立即放回-20℃。

6．注意防止試劑盒組分受污染，試劑盒之間的組分不要混用。

7．RNA提取過程中，請(qǐng)戴口罩、勤換手套，盡量縮短操作時(shí)間。

【操作方法】

一、樣品制備

1 樣品采集：病死或撲殺的禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于50%甘油生理鹽水中，2～8 ℃保存。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。） 

2 樣品處理： 

2.1 組織樣品的處理：每份組織分別從三個(gè)不同的位置稱取樣品約1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物；然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5 mL滅菌離心管中，8000 rpm離心2 min，取200 µL上清于1.5 mL 滅菌離心管中。

2.2 全血樣品的處理：待血凝后取200 µL血清于1.5 mL 滅菌離心管中。

2.3 陽性對(duì)照的處理：混勻后，取100 µL于1.5 mL 滅菌離心管中。

2.4 陰性對(duì)照的處理：混勻后，取100 µL于1.5 mL 滅菌離心管中。

二、病毒RNA的提取

1. 往裂解液中加入77.6µL BME，充分混勻。（加入了BME的裂解液請(qǐng)放4℃保存）

2. 取已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，分別加入600µL裂解液，充分顛倒混勻，室溫靜置10min 。

3. 加入600µL異丙醇，顛倒混勻。

4. 吸取650μL混合液轉(zhuǎn)入吸附柱中，12,000 rpm 離心45s，棄去收集管中液體，套回收集管。

5. 重復(fù)步驟4。

6. 向吸附柱中加入600µL洗滌液，12,000 rpm 離心45s，棄去收集管中液體，套回收集管。 

7. 重復(fù)步驟6。

8. 空柱12,000 rpm 離心2 min。 

9. 將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5 mL離心管中，在膜*加入25µL洗脫液，室溫靜置1min，12,000 rpm 離心45s，獲得總RNA。 

三、RT-PCR

1. 反應(yīng)體系配制：每份總體積20 µL，分別取16.8µL RT-PCR反應(yīng)液A（用前混勻）、1.2µL RT-PCR反應(yīng)液B和2µL模板RNA（陽性對(duì)照管加入1µL陽性對(duì)照RNA和1µL陽性模板添加液），混勻。

2. 反應(yīng)程序：在PCR儀上運(yùn)行以下程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min ；95 ℃ 30 s 、50℃ 40 s 、72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

四、電泳

1. 配制1.5%瓊脂糖凝膠。（請(qǐng)自備TAE電泳液、瓊脂糖和染色液。）

2. 向PCR產(chǎn)物中加入上樣緩沖液，混勻，取10μL混合物點(diǎn)樣于凝膠孔中，以5V/cm的電壓進(jìn)行電泳。

3. 當(dāng)溴酚蘭電泳至凝膠中下部時(shí)結(jié)束電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

【結(jié)果判斷】

    陽性對(duì)照出現(xiàn)545bp擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)545bp擴(kuò)增帶為禽流感病毒H5亞型陽性，否則為陰性。