考馬斯亮藍

考馬斯亮藍coomassie brilliant blue一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。

考馬斯亮藍有G-250和R-250兩種。

考馬斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，zui大光吸收在465nm；當它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有zui大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比。R-250與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條帶染色。

染色————————————————————————————————————

蛋白質(zhì)與G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1 000μg/mL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。

有G-250和R-250兩種。其中G-250由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)十分迅速，常用來作為蛋白質(zhì)含量的測定。R-250與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條帶染色。

測定含量————————————————————————————————————

簡介

該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較的，但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0．2%影響測定結(jié)果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用于細胞骨架的檢驗。

濃染液

將100mgG-250溶于50mL 95%乙醇，加入100mL濃磷酸，然后，用蒸餾水補充至200mL，此染液放4℃至少6個月保持穩(wěn)定。

樣本準備

盡量使用與待測樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標準品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標準蛋白。通常在20μg—150μg/100μL之間繪制標準曲線。

溶解

將待測樣本溶于100~1緩沖溶液中，該緩沖溶液應(yīng)與制作標準曲線的緩沖溶液相同(用PBS)。

稀釋

按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結(jié)合溶液，如出現(xiàn)沉淀，過濾除去。

作用

每個樣本加5mL

稀釋的染料結(jié)合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，將由紅色變?yōu)樗{色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應(yīng)不得超過30min．

計算

根據(jù)標準曲線計算待測樣本的濃度。

處理方法————————————————————————————————————

和皮膚中蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，反應(yīng)快速，并且穩(wěn)定，無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙。