過(guò)濾法無(wú)內(nèi)毒素快速質(zhì)粒中量提取試劑盒 技術(shù)動(dòng)態(tài)說(shuō)明

1. 質(zhì)?？截悢?shù)：純化中低拷貝的質(zhì)粒時(shí)，使用2倍的菌液體積，2倍的Buffer A1, B1, N3, RET, 100%乙醇，相同體積的Wash Buffer （70% 乙醇）和EndoFree Elution Buffer.
2. 轉(zhuǎn)化菌: 若為-70℃甘油凍存的菌，請(qǐng)先涂布平板培養(yǎng)后，再重新挑選新的單個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)。
3. 柱結(jié)合能力：250 μg
4. 對(duì)富含內(nèi)源核酸酶的宿主菌（endA＋）如HB101, JM101, TG1等，需去核酸酶，請(qǐng)使用產(chǎn)品PD1712。

1. 取50 µL新鮮的菌液接種到15-50 mL （勿超過(guò) 50 mL）的LB培養(yǎng)基（含適量抗生素），37^oC震蕩培養(yǎng)14-16小時(shí)。室溫下5,000 x g離心10分鐘，收集菌體，并盡可能的吸去上清。
2. 加入2.5 mL Buffer A1（確保已加入RNase A），用移液器或渦流震蕩確保細(xì)菌沉淀重新懸浮。
3. 加入 2.5 mL Buffer B1, 輕輕地反轉(zhuǎn)5-10 次以混合均勻，然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。 
4. 加入1 mL Buffer N3, 立即反轉(zhuǎn)5次，用手用力搖晃3-5次充分混勻，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
5. 將裂解液轉(zhuǎn)移至過(guò)濾器中，放在一個(gè)15 mL的試管上靜置10分鐘。管中的白色絮狀沉淀浮上來(lái)，對(duì)準(zhǔn)15 mL的管向下壓，使裂解液盡可能多的通過(guò)，有些裂解液可能會(huì)殘留在沉淀中。注：靜至10 分鐘時(shí)RNase A將工作，排除RNA污染。若離心十分鐘后再用過(guò)濾器過(guò)濾更有利于去除蛋白。
6. 向裂解液中加入1倍體積的Buffer RET （即每5 mL裂解液加入5 mL Buffer RET）,及3 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混勻，需馬上離心過(guò)DNA柱。
7. 立即轉(zhuǎn)移6 mL裂解液/收集管至帶收集管的DNA柱中，室溫下5,000 x g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)此步直至所有的溶液通過(guò)DNA柱。
8. 可選：向離心柱中加入5 mL Buffer KB，室溫下5,000 x g 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。
9. 向離心柱中加入5 mL 70% 乙醇，室溫下5,000 x g 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)步驟“9”。
10. 將離心柱放回高速離心機(jī)中，室溫下5,000 x g開(kāi)蓋離心10分鐘，以*去除殘留的乙醇。
11. 將離心柱轉(zhuǎn)至一個(gè)新的15 mL離心管中，向DNA柱膜的正中加入1 mL的Endofree Elution Buffer, 室溫放置1分鐘，5,000 x g 離心5分鐘，以洗脫質(zhì)粒DNA。將15 mL離心管中的洗脫液上柱再放置洗脫1分鐘，5,000 x g 離心5分鐘。 兩次洗脫將提高得率。

操作流程：