RNA提取原理與詳細(xì)步驟

原理

用Trizol 的溶液提取，將總RNA與 DNA 和蛋白質(zhì)分離。Trizol 是一種酸性溶液，含有硫氰酸胍 (GITC)、苯酚和氯仿。GITC 不可逆地使蛋白質(zhì)和 RNase 變性。隨后進(jìn)行離心。在酸性條件下，總 RNA 保留在上層水相中，而大部分 DNA 和蛋白質(zhì)保留在中間相或下層有機(jī)相中。然后通過(guò)用異丙醇沉淀回收總 RNA。RNase 酶可以通過(guò)加入吡咯碳酸二乙酯 (DEPC) 來(lái)滅活。

步驟

組織：每 100 毫克新鮮組織加入 1 毫升 TRIzol 試劑，使用無(wú)菌手術(shù)刀在冰上切碎，并用無(wú)菌勻漿器或其他設(shè)備勻漿。

細(xì)胞：如果是細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)在從培養(yǎng)箱中取出后立即進(jìn)行處理。細(xì)胞在室溫（15-25 oC）下以 1000rpm 離心5 分鐘，然后丟棄上清液或從單層生長(zhǎng)的細(xì)胞中去除培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗一次。每 1 × 10<7> 細(xì)胞加入 1 ml TRIzol 試劑。

1. 4°C 預(yù)冷離心機(jī)

2. 將組織或細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到 1.5毫升無(wú)RNA酶EP管中。置冰上，靜置 5 分鐘。

3. 每管加入200ul氯仿，充分混合后冰上靜置10分鐘，使核蛋白復(fù)合物解離。

4. 在 4°C 下以 13000 rpm離心 15 分鐘。期間，取一新EP管，加入500ul異丙醇，冰上預(yù)冷。

5. 離心后，將上層水相 (約500 ul) 轉(zhuǎn)移到該新的 EP管中。

6. 冰上靜置，酒精沉淀10min。

7. 離心， 13000 rpm， 10 分鐘。

8. 去除上清液。用 1ml 75% 乙醇洗滌 RNA 沉淀一次。

9. 12000rpm離心 5 分鐘。

10. 去掉上清，風(fēng)干或真空干燥 RNA 沉淀 5-10 分鐘。

11. 將 RNA 溶解在30-50ul DEPC 處理過(guò)的去離子水中（需根據(jù)RNA沉淀的量加水溶解）。

12. 進(jìn)行分光光度分析以確定樣品濃度和純度。