酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA）標(biāo)準(zhǔn)化的一般原則

酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA）標(biāo)準(zhǔn)化的一般原則

    對(duì)酶聯(lián)免疫測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化的目的就是通過這種標(biāo)準(zhǔn)化以改善實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的準(zhǔn)確度，從而提高不同的實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的可比性。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的先決條件是，標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)物應(yīng)該是相同的，否則標(biāo)準(zhǔn)化就無從談起。這在目前的許多臨床免疫測(cè)定項(xiàng)目中標(biāo)準(zhǔn)品往往沒有達(dá)到這一要求。

    涉及到免疫測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化的組織有世界衛(wèi)生組織（WHO）生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會(huì)（ECBS），其負(fù)責(zé)建立生物物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)及參比材料。WHO通過國(guó)家生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控物研究所（NIBSC）提供大多數(shù)多肽激素和一些腫瘤標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品。一些區(qū)域和地區(qū)性組織也制備標(biāo)準(zhǔn)品，如美國(guó)的疾病控制中心（CDC）、美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)（CAP）的國(guó)家委員會(huì)。國(guó)家衛(wèi)生研究所（NIH）提供尤其是用于研究目的的多肽激素標(biāo)準(zhǔn)品。IFCC也已組織制備了一種脂蛋白和血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品，可通過CAP得到。癌發(fā)生生物學(xué)和醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)已啟動(dòng)一個(gè)腫瘤標(biāo)志物的決定計(jì)劃。在國(guó)內(nèi)中國(guó)藥品生物制品檢定所提供一些多肽激素、腫瘤標(biāo)志物等標(biāo)準(zhǔn)品。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心則為全國(guó)各級(jí)醫(yī)院血站實(shí)驗(yàn)室提供室內(nèi)質(zhì)控物。盡管僅僅使用標(biāo)準(zhǔn)品并不能保證免疫測(cè)定結(jié)果的可比性，但標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)保證免疫測(cè)定的重要性是不言而喻的。目前在世界上有各種不同的科學(xué)協(xié)會(huì)如IFCC及國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）以及美國(guó)和加拿大臨床化學(xué)協(xié)會(huì)（AACC和CSCC）等正致力于免疫測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化工作，這些組織也制備一些標(biāo)準(zhǔn)品。在美國(guó)，免疫測(cè)定必須有食品和藥物管理局（FDA）的批準(zhǔn)。在德國(guó)的監(jiān)督機(jī)構(gòu)是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化和文件化研究所（INSTAND）。在國(guó)內(nèi)免疫診斷試劑的審批由國(guó)家*（SDA）負(fù)責(zé)。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心也正在著手臨床免疫檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化方面的工作。

    *代生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品是在70多年前由Henry Dale制備的用于胰島素測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品，該標(biāo)準(zhǔn)品被WHO的前身即國(guó)家衛(wèi)生組織聯(lián)合會(huì)（League Of National Health Organization）所采用。從那時(shí)起，在一系列標(biāo)準(zhǔn)品（IS）中胰島素制劑的含量以單位（IU）表示，每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品均用前一個(gè)進(jìn)行校準(zhǔn)。其后，對(duì)大多數(shù)重要的多肽激素和其他具有“復(fù)雜分子組成的物質(zhì)”（即不能僅通過使用物理和化學(xué)方法*鑒定其均一性、效力或安全性的物質(zhì)）均制備了標(biāo)準(zhǔn)品。每一種IS的單位由ECBS在合作研究的基礎(chǔ)上確定。并評(píng)估提出來作為一種IS的制劑在不同的試驗(yàn)系統(tǒng)中的適用性。生物試驗(yàn)主要是用于多肽激素標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)和使用以前的舊標(biāo)準(zhǔn)晶對(duì)新標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)。因此，單位通常表示生物活性，但其也用于缺乏已知生物活性的物質(zhì)。通常標(biāo)準(zhǔn)品的制備批量應(yīng)至少夠用10—20年。

    對(duì)于臨床分析測(cè)定來說，標(biāo)準(zhǔn)品和參考制劑可用作校準(zhǔn)物，而在每個(gè)具體的實(shí)驗(yàn)室中，其可用來評(píng)價(jià)試驗(yàn)的有效性，以及作為室內(nèi)質(zhì)控樣本，對(duì)測(cè)定的質(zhì)量評(píng)價(jià)來說，也是非常有價(jià)值的。術(shù)語“IS”取代了已被WHO用于某些標(biāo)準(zhǔn)品的術(shù)語“參考制劑”（IRP）。目前使用的人絨毛膜促性腺激素（hCG）剛開始被稱為*代IRP，后來被稱為第三代IS。盡管大多數(shù)IS制劑由溶解在含一載體蛋白的緩沖液中的純抗原所組成，但某些標(biāo)準(zhǔn)品（如血清蛋白）是以血清作為基質(zhì)材料的。標(biāo)準(zhǔn)品可歸類為*、第二和第三等三個(gè)等級(jí)。一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量有限，可使用10～20年，為凍干品，內(nèi)含載體蛋白。一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可用來校準(zhǔn)第二和第三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，例如，常規(guī)測(cè)定中使用的校準(zhǔn)品。IS可作為*級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品，一旦*級(jí)標(biāo)準(zhǔn)確定，二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可用來維持校準(zhǔn)。校準(zhǔn)的二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可在以國(guó)家為基礎(chǔ)的范圍內(nèi)供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)品的特性應(yīng)該清楚明確，理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)該是純的但仍需有特定分析物質(zhì)可能的同種型不均一性，這種要求通常難以達(dá)到，因?yàn)樵诩兓^程中，使用生化方法去除雜質(zhì)會(huì)引起少量的同種型丟失。免疫親和層析純化方法可用來提取所有特異的同種型，但洗提過程常需在低pH變性條件下進(jìn)行，這種變性條件可能會(huì)引起某些蛋白的不可逆修飾。免疫親和層析純化方法也可使用在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)生成的蛋白，但表達(dá)產(chǎn)物仍需純化和糖基化，而糖基化又可能與天然蛋白有所不同。

    目前可得到的標(biāo)準(zhǔn)品中特定分析物的濃度一般以U／L表示，而已經(jīng)很明確的物質(zhì)如類固醇和甲狀腺激素，則應(yīng)以物質(zhì)濃度（m01／L）表示。但已很明確的肽類激素的數(shù)量也正在不斷增加，因此，雖然促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和胰島素已有標(biāo)準(zhǔn)品，但其濃度常以m01／L或g／L而不是U／L來表示。鑒定明確的腫瘤標(biāo)志物的濃度常以質(zhì)量濃度（g／L）表示，而不太明確的標(biāo)志物則以的單位（U／L）表示。激素濃度以U／L表示會(huì)給人這樣一個(gè)印象，即所測(cè)定的是具有生物學(xué)活性的激素的濃度，但免疫測(cè)定并不能測(cè)定生物活性，其實(shí)際上測(cè)定的是抗原上一個(gè)決定基（epitope）或一組決定基的摩爾濃度，尤其是使用單克隆抗體進(jìn)行測(cè)定時(shí)。因此，質(zhì)量濃度（以m01／L表示）zui能確切地反映所測(cè)定的是什么。即使蛋白的糖的組成和等電點(diǎn)不均一，氨基酸分析也可準(zhǔn)確地測(cè)定純化蛋白的含量。糖蛋白質(zhì)量的稱重測(cè)定是不準(zhǔn)確的，因?yàn)槠浜薪Y(jié)合很緊的水，凍干并不能去除。第四代hCG標(biāo)準(zhǔn)品將通過氨基酸分析的方法來測(cè)定，以m01／L來表示，至于將現(xiàn)有的第三代標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換至第四代的轉(zhuǎn)換因子可通過免疫測(cè)定進(jìn)行交叉校準(zhǔn)確定。如果一個(gè)免疫試驗(yàn)測(cè)定分子量不同但免疫反應(yīng)性相同的同一物質(zhì)的不同分子變異體，則質(zhì)量濃度可正確地反映不同成分的濃度，然而，如果不同的分子形式?jīng)]有相等的免疫反應(yīng)性，則質(zhì)量濃度也會(huì)出現(xiàn)偏差，該問題可通過使用具有適當(dāng)特異性的抗體和標(biāo)準(zhǔn)品來解決。

    當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)晶更換時(shí)也會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化方面的問題，一個(gè)新的標(biāo)準(zhǔn)品可能會(huì)改變?cè)\斷免疫試驗(yàn)的效果估價(jià)，盡管已進(jìn)行了仔細(xì)的校準(zhǔn)。使用生物試驗(yàn)校準(zhǔn)激素標(biāo)準(zhǔn)品頗為復(fù)雜，生物試驗(yàn)較之免疫試驗(yàn)的重復(fù)性要差，對(duì)免疫反應(yīng)性影響不大的激素的糖組成成分對(duì)其生物活性卻影響較大，用于體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的效果是不一樣的。如果一新的激素標(biāo)準(zhǔn)品是根據(jù)生物活性來進(jìn)行校準(zhǔn)的，則將其用于免疫測(cè)定時(shí)會(huì)有所不同。如卵泡刺激激素標(biāo)準(zhǔn)FSH83／575用于FSH免疫測(cè)定校準(zhǔn)時(shí)，其變化因子為4，但催乳激素、促黃體生成激素（LH）和生長(zhǎng)激素則不引起或只引起很小的改變。

    從一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的值傳遞到zui終試驗(yàn)所使用的校準(zhǔn)物的過程通常由幾個(gè)校準(zhǔn)步驟組成，包括標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)定方法、緩沖液及其基質(zhì)、稀釋的控制、zui終結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制等。當(dāng)建立一個(gè)測(cè)定方法時(shí)，一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品的值要傳遞至二級(jí)、三級(jí)和（或）校準(zhǔn)品，使得所建立的方法的測(cè)定值可溯源至一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品。當(dāng)引入一批新的試劑時(shí)，即需要重復(fù)這種傳遞過程，從而保持校準(zhǔn)的可靠性。不同的分析物如血清蛋白、多肽激素或與載體蛋白結(jié)合的低分子量激素等其校準(zhǔn)過程有所不同。

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