肝特異性脂蛋白LSP的檢測方法

肝特異性脂蛋白LSP的檢測方法

    肝特異性脂蛋白（1iverspecificlipoprotein，LSP）為一種大分子的脂質(zhì)相關(guān)復(fù)合物，含有大量肝細胞漿膜抗原，其中大部分是器官非特異性的，部分是肝特異性的。LSP抗原還存在種屬非特異性的抗原決定簇。LSP的種屬非特異性在人、兔之間，器官特異性在肝、腎之間更為接近。

    因此在制備LSP抗原時，可用兔肝代替人肝；但在檢測抗LSP抗體時，應(yīng)考慮到腎病的相互干擾。由于LSP可能是活體內(nèi)免疫病理反應(yīng)的靶抗原，抗LSP可以通過抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒（ADCC）途徑殺傷自身肝細胞，并認為此可能是導(dǎo)致體內(nèi)肝細胞持續(xù)性損傷的主要因素。因此，近年來研究較多的是抗LSP的各種Ig類別。抗LSP抗體的檢測有放射免疫沉淀法、放射免疫自顯影法以及ELISA法等。現(xiàn)介紹ELISA法。

    1．試劑  ①LSP抗原：將新鮮正常人肝或兔肝除去包膜，剪成小塊，用自來水，生理鹽水洗去血液，直到肝組織顏色發(fā)白。稱重，加等量（W／V）0．25mol／L蔗糖（EDTA-Tris緩沖液1 000mL，含蔗糖85．6g）溶液，于高速組織搗碎機中勻漿5min，3 000r／rain離心30min，除去沉淀。上清加硫酸銨使達50％飽和度，4cC靜置1h后，3000r／min離心20rain，棄上清。沉淀溶于EDTA-Tris緩沖液，過SephadexC—100凝膠柱，用同一緩沖液洗脫，收集*蛋白峰。加硫酸銨使達50％飽和度，4cC靜置1h，3000r／min離心20min，收集沉淀溶于ED-TA-Tris緩沖液中，再過Sepharose 6B柱，同一緩沖液洗脫，收集*蛋白峰，即為LSP；②酶結(jié)合物：HRP標(biāo)記的羊抗人IgG、IgA、IgMF（ab’）：段。

    2．操作步驟  在聚苯乙烯板孔中加入0．15mLLSP溶液（25ug／mL），置37℃!h后，4~C過夜，洗3次，每次3min（以下同）；每孔加1：50稀釋的待檢血清0．1mL，置37~C1h，洗3次；加zui適工作濃度的抗人IsC（或抗IzA、IgM）酶結(jié)合物0．1mL，37~C1h，洗3次；加底物溶液，37％20min顯色后，用2mol／LH2S04終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀492nm波長測吸光度值。每板均設(shè)陽性、陰性對。

    3．結(jié)果觀察  P／N值≥1．1為陽性。P／N值計算法如下：

P/N=P/（Xn+2S）

    P為待測血清吸光度值，Xn為50—100例正常對照血清的吸光度均值。

    4．臨床意義  抗LSP-IgG的檢測也與肝炎病型的輕重有關(guān)，且滴度隨病情變化而波動；進行動態(tài)觀察，可以估計病情變化。抗LSP-IgM主要見于重癥肝炎和急性肝炎，出現(xiàn)早，續(xù)時間短，似可做為肝細胞損傷的早期指標(biāo)。抗LSP-IgA可能主要出現(xiàn)于自身免疫反應(yīng)持續(xù)時間較長的病例，對于區(qū)別急性肝炎和慢性肝炎急性波動有一定的意義。在慢性腎病中，可出現(xiàn)一些交叉反應(yīng)，應(yīng)予鑒別。 

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