效毛細(xì)管電色譜儀（CEC）整合了液相色譜（HPLC）和毛細(xì)管電泳（CE）的優(yōu)點(diǎn)，在毛細(xì)管柱中填充固定相顆粒、管壁鍵合或涂覆固定相、制成連續(xù)床固定相，以壓力和電滲流共同驅(qū)動流動相，利用樣品各組分在固定相和流動相中分配系數(shù)差異和本身淌度差異進(jìn)行分離。在HPLC和CE雙重分離機(jī)理的作用下，CEC對樣品細(xì)微之處的分辨能力得到極大提高，既能分離帶電組分，又能分析中性分子，對復(fù)雜的混合樣品顯示出強(qiáng)大的分離潛力，代表微分離分析的趨勢。
    一、發(fā)展歷史：
    1974年，CEC出現(xiàn)，將電場施加到填充毛細(xì)管柱上，分離了數(shù)種溶質(zhì)，顯示出以電滲流作為驅(qū)動力的*性。但當(dāng)時并沒有引起足夠的關(guān)注。
    1981年，將10μm ODS填料填入170μm內(nèi)徑的毛細(xì)管柱中，在電場作用下成功分離了數(shù)種多環(huán)芳烴，獲得了31000TP/m的柱效，*次展示了CEC的巨大潛力。
    二、工作原理：
    CEC采用HPLC固定相，通過高壓輸液泵產(chǎn)生的液壓和在毛細(xì)管柱兩端加上高壓直流電場所產(chǎn)生的電場力，即依靠液壓和電滲流共同驅(qū)動流動相，使樣品組分根據(jù)它們的色譜行為和電泳速度的不同而達(dá)到分離。CEC具有HPLC和CE雙重分離機(jī)理，如同HPLC基于組分在固定相和流動相中的分配過程，如同CE基于組分的電遷移過程，使分離選擇性得到極大提高。電滲流的塞形流型改善了組分在毛細(xì)管柱中的流型和峰展寬，可獲得遠(yuǎn)高于HPLC的柱效，對復(fù)雜樣品的分離能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過單獨(dú)使用HPLC和CE。
    三、輸液系統(tǒng)：
    1、驅(qū)動流動相的動力：
    以高壓輸液泵和電滲流泵共同驅(qū)動流動相，流動相在液壓和電滲流的共同作用下通過毛細(xì)管柱，可穩(wěn)定輸送幾百納升的流量。液壓和電壓可同時或獨(dú)立地施加在毛細(xì)管柱兩端，具有以下明顯的優(yōu)勢：
    （1）可有效抑制分離體系中氣泡的產(chǎn)生。
    （2）采用壓力流和閥進(jìn)樣，可方便地實現(xiàn)二元溶劑梯度洗脫，提高分析的靈活性、選擇性和分離速度。
    （3）從進(jìn)樣到分離的整個過程中，高壓直流電場不間斷，保證了系統(tǒng)的穩(wěn)定性和分析的重現(xiàn)性。
    2、微流控制系統(tǒng)：
    微流控制系統(tǒng)由分流閥、反壓閥、溶劑混合閥、定量進(jìn)樣閥和限流閥等組成。
    （1）分流閥和反壓閥：
    維持恒定的毛細(xì)管柱前壓是色譜體系穩(wěn)定的關(guān)鍵，可通過分流閥和反壓閥來實現(xiàn)。溶劑由高壓輸液泵以恒流形式泵出，在分流閥處轉(zhuǎn)為恒壓形式驅(qū)動，從而與高壓直流電場的電滲流相匹配，實現(xiàn)由樣品壓力和電場對柱內(nèi)溶劑的同時驅(qū)動。
    （2）溶劑混合閥：
    50μL溶劑混合閥可實現(xiàn)二元溶劑的梯度混合，在保證混合效率的同時，抑制了梯度延時，保證了分析的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。
    （3）定量進(jìn)樣閥：
    定量進(jìn)樣閥為納升級定容進(jìn)樣，保證了進(jìn)樣的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。壓力流和進(jìn)樣閥的存在，使系統(tǒng)可與樣品處理相連，實現(xiàn)實時在線樣品分析。
    該閥采用內(nèi)置定量環(huán)，通過刻蝕實現(xiàn)納升級定量環(huán)的加工。定量環(huán)的出口通道為100μm，可通過PEEK接頭與100μm內(nèi)徑的毛細(xì)管柱相連，極大地抑制了死體積的影響。
    （4）限流閥：
    限流閥的作用是在毛細(xì)管柱的出口端保持一定壓力，可抑制由于壓力驟然變化引起的氣泡，保證系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
    （5）微流控制系統(tǒng)的連接管路：
    微流控制系統(tǒng)的連接管路的內(nèi)徑與定量進(jìn)樣閥接口處的孔徑相同，從zui大程度上減小了進(jìn)樣死體積和柱外體積的影響。
    四、高壓直流電源：
    1、0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源。
    2、具有恒壓、恒流和恒功率輸出。
    3、具有電場強(qiáng)度程序控制功能。
    4、電壓穩(wěn)定性在±0.1%。
    5、電源極性易轉(zhuǎn)換。
    五、固定相：
    固定相是影響電色譜柱柱效、分離選擇性和分離速度的重要因素，是發(fā)展新型CEC分離模式的基礎(chǔ)。
    固定相的選擇主要依據(jù)HPLC的理論和經(jīng)驗。HPLC的各種固定相已被應(yīng)用于CEC中，其中十八烷基硅烷鍵合硅膠固定相（ODS）應(yīng)用zui多。CEC結(jié)合了HPLC和CE的動力優(yōu)勢，不單純依靠壓力驅(qū)動毛細(xì)管柱中流動相的流動，還通過在毛細(xì)管柱兩端加上高壓直流電場所產(chǎn)生的電場力驅(qū)動，大大降低了柱內(nèi)壓力。因此，CEC進(jìn)行分析時，可使用內(nèi)徑細(xì)小的毛細(xì)管柱和粒徑超小的填料（1.5～3μm），而不用擔(dān)心高反壓，大大提高了柱效和分離效果。實驗表明，只要固定相顆粒粒徑≥0.5μm，電滲流速度與固定相顆粒大小和填充均勻程度無關(guān)。
    分離手性化合物時，可在固定相上鍵合手性選擇劑，也可用非手性固體相在緩沖液中加入手性選擇劑進(jìn)行拆分。
    混合官能團(tuán)固定相是專門針對CEC研制的新型固定相，是在硅膠表面同時鍵合具有反相色譜性能的烷基官能團(tuán)和具有離子交換性質(zhì)的磺酸官能團(tuán)，在很寬的pH范圍內(nèi)都能保持良好的電滲流。
    六、流動相：
    根據(jù)固定相的正相和反相等特性，流動相可以是水溶液或有機(jī)溶液。常用流動相有乙腈－水、甲醇－水等。
    七、電色譜柱：
    電色譜柱是CEC的核心部件，按固定相形式不同可分為填充毛細(xì)管柱、開管毛細(xì)管柱和整體毛細(xì)管柱。
    1、填充毛細(xì)管柱：
    填充毛細(xì)管柱是將固定相填充到毛細(xì)管中，通過兩端燒結(jié)柱塞將固定相保持在毛細(xì)管中而成。其zui大優(yōu)點(diǎn)是可利用眾多的HPLC固定相，根據(jù)化合物與固定相的作用不同實現(xiàn)分離，在CEC中應(yīng)用zui廣泛。
    （1）制備方法：
    1）柱塞：
    柱塞制備對填充毛細(xì)管柱非常關(guān)鍵。
    ①柱塞必須滿足的要求：
    有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，能承受填充時的高壓。
    化學(xué)惰性，耐有機(jī)溶劑和寬pH值的緩沖液。
    有合適的孔隙度，既不使流動相受阻，又可防止固定相顆粒通過。
    死體積小，避免峰展寬。
    ②柱塞制備方法：
    柱塞制作方法很多，目前應(yīng)用較多的是水玻璃燒制法和填料直接燒制法。
    2）填充毛細(xì)管柱：
    填充毛細(xì)管柱的填充方法有高壓勻漿填充法、電動填充法和超臨界CO2法等。
    ①高壓勻漿填充法：
    高壓勻漿填充法是填充毛細(xì)管柱zui常用的制備方法。
    填充過程一般包括燒結(jié)進(jìn)樣端柱塞、高壓填充、燒結(jié)出口端柱塞、除去不需要的固定相和檢測窗口制作等步驟。
    高壓勻漿填充法簡單，快速，但操作技術(shù)要求較高。由于在分離樣品時施加電場，會使表面帶電荷的固定相沿某一方向電泳，容易造成柱局部過于緊密產(chǎn)生較大的壓力，而局部由于固定相遷移形成較大的空隙。
    ②電動填充法：
    電動填充是利用電泳原理，使固定相在一定pH下帶電荷，在電場中定向移動而把固定相填充到毛細(xì)管中。與高壓勻漿填充法相比，電動填充法可有選擇地把荷質(zhì)比相同的固定相填入毛細(xì)管中，柱床均勻。
    ③超臨界CO2法：
    超臨界CO2法是在毛細(xì)管柱一端制作臨時柱塞后，另一端與貯液罐相連，將預(yù)填充的填料放入貯液罐中，然后利用超臨界CO2將填料填入毛細(xì)管中，再緩慢釋放壓力至常壓而得到干的色譜柱。柱使用前用流動相潤洗，平衡。
    （2）特點(diǎn)：
    1）優(yōu)點(diǎn)：
    ①柱效高。
    ②固定相資源豐富。
    2）缺點(diǎn)：
    ①存在柱塞制備和柱填充，步驟繁瑣。
    ②重現(xiàn)性差。
    （3）氣泡問題：
    填充毛細(xì)管柱CEC操作的困難是分離過程中常伴有氣泡產(chǎn)生。氣泡一般產(chǎn)生在柱塞與固定相交界處和柱塞與檢測窗口交界處。為了控制氣泡產(chǎn)生，目前主要采取以下措施：
    1）在柱兩端同時施加低壓，可較好的解決氣泡問題。
    2）制備滲透性好的柱塞。
    3）在分流閥處接一阻尼管，當(dāng)電極處有氣泡產(chǎn)生時，氣泡會經(jīng)分流閥通過阻尼管排出。
    4）利用超聲波使流動相和樣品充分脫氣。
    2、開管毛細(xì)管柱：
    開管毛細(xì)管柱是將固定相鍵合或涂敷在毛細(xì)管壁上，引入色譜分配機(jī)理。
    （1）制備方法：
    開管毛細(xì)管柱制備的關(guān)鍵是增大比表面積，以制備相比大和柱容量大的色譜柱。
    1）鍵合固定相。
    2）涂覆聚合物固定相。
    3）溶膠－凝膠法。
    4）分子印記法。
    （2）特點(diǎn)：
    1）優(yōu)點(diǎn)：
    ①與填充毛細(xì)管柱相比，由于沒有渦流擴(kuò)散，分離效率更高，分離時間大大縮短。
    ②由于不用柱塞，制備簡單，減小了氣泡產(chǎn)生的可能性。
    2）缺點(diǎn)：
    開管毛細(xì)管柱的相比是填充毛細(xì)管柱的1/350，柱容量小，對溶質(zhì)的保留有限。
    為了增加相比和柱容量，開管毛細(xì)管柱一般使用比較細(xì)的毛細(xì)管（＜25μm），通過各種方法對管壁進(jìn)行處理。
    3、整體毛細(xì)管柱：
    整體毛細(xì)管柱是采用有機(jī)和無機(jī)方法在毛細(xì)管中進(jìn)行原位自由基聚合反應(yīng)或固化，形成連續(xù)床固定相。目前是電色譜柱研究的熱點(diǎn)。
    整體毛細(xì)管柱一般采用柱內(nèi)直接鍵合的方法形成整塊多孔的交聯(lián)聚合物，不用柱塞，簡化了柱制備過程。通過改變單體可引入多種官能團(tuán)，有更好的多孔性和滲透性，對流動相阻力小，溶質(zhì)在固定相和流動相之間快速分配，有利于實現(xiàn)高速分離?？蓪ι锎蠓肿舆M(jìn)行快速分離。
    按基質(zhì)不同可分為無機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱、有機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱、顆粒固定化整體毛細(xì)管柱和雜化材料整體毛細(xì)管柱。
    （1）無機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱：
    無機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱是通過溶膠－凝膠反應(yīng)使硅烷化試劑形成牢固的Si－O－Si網(wǎng)絡(luò)骨架。溶膠－凝膠反應(yīng)一般包括至少一種前導(dǎo)物質(zhì)（通常是烷氧基硅烷）、溶劑、催化劑、有機(jī)添加劑和水，將這些物質(zhì)的溶液引入經(jīng)預(yù)處理的毛細(xì)管后，在柱中水解縮聚生成凝膠，然后進(jìn)行老化、干燥，制成硅膠基質(zhì)整體毛細(xì)管柱。
    在溶膠－凝膠反應(yīng)過程中，催化劑HCl和單體含量對整體柱的結(jié)構(gòu)有影響。增加HCl濃度可增加柱強(qiáng)度，增加分離效率。當(dāng)HCl濃度低時，沒有足夠的硅醇基水解形成網(wǎng)絡(luò)骨架。增加單體和致孔劑的比率會減小孔徑，增加骨架密度，降低滲透性。當(dāng)單體濃度小于5%時，單體只能與管壁結(jié)合，不能形成整體柱。當(dāng)單體濃度大于18%時，柱滲透性非常差。
    溶膠－凝膠技術(shù)具有純度高、均勻性好和合成溫度低等特點(diǎn)，近年在材料科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。
    硅膠基質(zhì)整體毛細(xì)管柱機(jī)械強(qiáng)度良好，耐有機(jī)溶劑，硅膠骨架和通孔尺寸可獨(dú)立控制，但使用過程會出現(xiàn)收縮、開裂和干結(jié)等問題，很多情況下柱制備和修飾不能同時進(jìn)行。
    另外，還有以氧化鋯和二氧化鈦為基質(zhì)的整體柱，但這方面的研究遠(yuǎn)不及硅膠基質(zhì)整體毛細(xì)管柱廣泛和深入。
    （2）有機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱：
    有機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱有以聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯為基質(zhì)的整體柱。典型的聚合液以含一個乙烯基的化合物為單體，以含兩個乙烯基的化合物為交聯(lián)劑，以含離子基團(tuán)的化合物為產(chǎn)生電滲流的單體，為了形成多孔結(jié)構(gòu)往往添加致孔劑。
    有機(jī)基質(zhì)整體毛細(xì)管柱種類比較單一，機(jī)械強(qiáng)度較差，容易發(fā)生收縮和溶漲現(xiàn)象，使柱性能發(fā)生變化，影響柱壽命。
    1）聚丙烯酰胺基質(zhì)整體毛細(xì)管柱：
    以聚丙烯酰胺為基質(zhì)的整體柱從1995年出現(xiàn)以來得到了廣泛應(yīng)用。zui初的整體柱一般以丙烯酰胺為單體，以亞甲基二丙烯酰胺為交聯(lián)劑，以含離子基團(tuán)的化合物為產(chǎn)生電滲流的單體，所得到的整體柱是親水性較強(qiáng)的柱床。為了獲得疏水性較強(qiáng)的柱床，可添加疏水性較強(qiáng)的單體，如十四烯、十六烯和十八烯等，利用反相機(jī)制進(jìn)行分離。
    2）聚甲基丙烯酸酯基質(zhì)整體毛細(xì)管柱：
    以聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的整體柱是硬質(zhì)柱床，柱制備比較簡單，毛細(xì)管壁可不經(jīng)過預(yù)處理將聚合物混合液引入到柱中后，經(jīng)水熱處理可得到柱體與管壁結(jié)合很好的整體柱。
    以2－（*基磺酸甲酯銨）乙基甲基丙烯酸酯（MEAMS）為單體，以乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，以正丙醇和1，4－丁二醇的混合液為致孔劑，可得到具有反相和離子交換混合模式的整體柱。MEAMS中的銨基既作為產(chǎn)生反向電滲流的基團(tuán)，又作為強(qiáng)離子交換固定相。該整體柱對中性化合物表現(xiàn)出反相色譜機(jī)制，對帶電荷的物質(zhì)既有反相作用機(jī)制，又有離子交換作用機(jī)制。使用該整體柱分離堿性化合物時，還消除了一般電泳和電色譜中由于堿性化合物吸附所造成的峰拖尾現(xiàn)象。
    3）聚苯乙烯基質(zhì)整體毛細(xì)管柱：
    以聚苯乙烯為基質(zhì)的整體柱是硬質(zhì)整體柱。目前單體種類比較少，一般是苯乙烯－二乙烯苯共聚物。
    （3）顆粒固定化整體毛細(xì)管柱：
    顆粒固定化整體毛細(xì)管柱是將填料的溶膠－凝膠懸浮液引入毛細(xì)管中進(jìn)行原位聚合，或?qū)⑻盍项w粒填充到毛細(xì)管中后，再采用如高溫?zé)Y(jié)、溶膠－凝膠等方式，形成連續(xù)床層的整體柱。由于顆粒的存在，減少了柱制備過程中的收縮和干裂。
    （4）雜化材料整體毛細(xì)管柱：
    采用有機(jī)－無機(jī)雜化的方法，使整體柱的形成和衍生同時完成。柱制備簡單，可通過調(diào)節(jié)不同前導(dǎo)物質(zhì)的比例來調(diào)整疏水相在整體柱中的比例。
    八、檢測器：
    CEC的檢測器有紫外檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器、質(zhì)譜檢測器和拉曼光譜檢測器等。
    九、特點(diǎn)：
    1、超分離：
    分離效率比HPLC高，25萬以上TP/m。
    2、超快速分離：
    30s內(nèi)可完成4種樣品的分離。
    3、超高峰容量：
    3倍于HPLC的峰容量。
    4、超高分離精度：
    重現(xiàn)性與HPLC相媲美。
    5、超高選擇性：
    選擇性比CE高。
    6、梯度洗脫：
    微流控制系統(tǒng)顯著降低了體系的死體積，可實現(xiàn)高壓梯度洗脫，可分離分子結(jié)構(gòu)相近或電泳淌度接近的混合物。
    7、定量進(jìn)樣：
    納升級閥進(jìn)樣，大幅度提高了進(jìn)樣的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。
    8、微流化，環(huán)境友好：
    CEC的毛細(xì)管柱中流量為0.2～1μL/min，消耗溶劑和樣品量是HPLC的萬分之一。HPLC的進(jìn)樣量為微升級，無法分析納升級樣品。CEC的進(jìn)樣量只為納升級，過多的取樣量往往會致死本體，在活體取樣時體現(xiàn)出巨大優(yōu)勢。
    與HPLC相比，CEC的分析時間更短、柱內(nèi)徑更細(xì)、分離速度更快，使溶劑消耗量更少，由此產(chǎn)生的廢液更少，大大降低了成本，保護(hù)環(huán)境。
    十、應(yīng)用：
    CEC為蛋白質(zhì)組學(xué)、生物醫(yī)藥學(xué)、天然藥物分析、環(huán)境保護(hù)、食品安全和手性化合物分析等領(lǐng)域提供了創(chuàng)新的技術(shù)手段。填充毛細(xì)管電色譜在蛋白質(zhì)分析中有重要潛力。