土壤淀*酶（S-AL）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。

貨號(hào)：BC1925

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取1瓶加入5 mL蒸餾水，置于常溫水中并加熱至煮沸，期間不斷攪拌或震蕩至粉劑溶解，用不完的試劑2-8℃保存一周。

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg麥芽糖。臨用前加入1.38 mL蒸餾水配制成20 μmol/mL的儲(chǔ)備液，2-8℃保存兩周。

產(chǎn)品說(shuō)明：

淀*酶（EC3.2.1.1）是催化淀粉水解的一類酶的總稱。土壤中的淀*酶主要來(lái)自于微生物，是一種重要的酶制劑，廣泛應(yīng)用于糧食加工、食品、釀造、發(fā)酵、紡織品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)。

淀*酶水解淀粉產(chǎn)生還原糖，可與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)生成紅棕色物質(zhì)，在540nm處有特征吸收峰，顏色深淺在一定范圍內(nèi)與還原糖量成正比。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

天平、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、30~50目篩、研缽、甲苯（不允許快遞）。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

新鮮土樣自然風(fēng)干或37℃烘箱風(fēng)干，過30~50目篩。

二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，波長(zhǎng)調(diào)至540nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2. 將20μmol/mL的麥芽糖儲(chǔ)備液用蒸餾水稀釋為 2、1、0.8、0.6、0.4μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度稀釋表

備注：實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需60µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4. 操作表：

三、土壤淀*酶活力的計(jì)算

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測(cè)定（y，ΔA測(cè)定）帶入公式計(jì)算樣本濃度（x，μmol/mL）

2、酶活的計(jì)算：

單位的定義：每天每g土樣產(chǎn)生1μmol還原糖定義為一個(gè)土壤淀*酶活力。

S-AL（U/g 土樣）= x×V反總÷W÷T=0.21×x÷W

V反總：酶促反應(yīng)總體積，0.21mL；W：土樣質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，1d。

注意事項(xiàng)：

1、 當(dāng)ΔA大于1.5時(shí)，建議將上清液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，注意在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2、 若ΔA測(cè)定較小，增加反應(yīng)的上清液體積或適當(dāng)增加酶促反應(yīng)時(shí)間，計(jì)算酶活時(shí)對(duì)公式進(jìn)行修改。

3、 建議每次實(shí)驗(yàn)煮沸后的冷卻時(shí)間保持一致，吸光值請(qǐng)于30min內(nèi)測(cè)定完成。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.05g土樣于1.5mLEP管中，依次加入10μL甲苯、100μL試劑一、100μL試劑二為測(cè)定管；取0.05g土樣于1.5mLEP管中，依次加入10μL甲苯、100μL試劑一、100μL蒸餾水為對(duì)照管，均放于37℃培養(yǎng)24h，后離心取上清再液稀釋3倍，之后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定 =A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.948-0.12=0.828，標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.7604x-0.158，x=1.297，按土樣質(zhì)量計(jì)算酶活得：

S-AL（U/g 土樣）=0.21×x÷W×3（稀釋倍數(shù)）=0.21×1.297÷0.05×3（稀釋倍數(shù)）=16.34 U/g 土樣。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kathiresan K, Manivannan S. α-Amylase production by Penicillium fellutanum isolated from mangrove rhizosphere soil[J]. African journal of Biotechnology, 2006, 5(10).

[2] Ebregt A, Boldewijn J. Influence of heavy metals in spruce forest soil on amylase activity, CO 2 evolution from starch and soil respiration[J]. Plant and Soil, 1977, 47(1): 137-148.

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