目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-常量法>>脂肪酸代謝系列>> BC6020-50T/48S乙酰輔酶羧化酶活性檢測試劑盒 脂肪酸
CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
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分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
供貨周期 | 一周 | 規(guī)格 | 50T/48S |
貨號 | BC6020-50T/48S | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
主要用途 | 乙酰輔酶 羧化酶(ACC)活性檢測 |
乙酰輔酶羧化酶(ACC)活性檢測試劑盒(酶法)說明書
紫外分光光度法
注意:本產(chǎn)品試劑有所變動,請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號:BC6020
規(guī)格:50T/48S
產(chǎn)品組成:使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體0.6 mL×1支 | -20℃保存 |
試劑一A | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一B | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體60 μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體25 μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑六 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制:
1.提取液二:為易揮發(fā)試劑,用完后盡快密封,-20℃保存。
2.提取液的配制:按提取液一:提取液二=990μL:10μL(共1mL,約1T)的比例配制,根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用,禁止將提取液二一次性全部加入提取液一中。
3.試劑一:臨用前將試劑一B全部倒入試劑一A,充分溶解待用;可分裝后-20℃保存4周,避免反復(fù)凍融。
4.試劑二:試劑放于棕色瓶內(nèi)玻璃瓶中,臨用前加入12mL蒸餾水,充分溶解待用;可分裝后-20℃保存4周,避免反復(fù)凍融。
5.試劑三稀釋液:臨用前離心,根據(jù)樣本量按照試劑三:蒸餾水=1μL:50μL(共51μL,約1T)的比例充分混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用。
6.試劑四稀釋液:臨用前離心,根據(jù)樣本量按照試劑四:蒸餾水=4μL:500μL(共504μL,約10T)的比例充分混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用。
7.試劑五:試劑放于棕色瓶內(nèi)玻璃瓶中,臨用前加入12mL蒸餾水;可分裝后-20℃保存4周,避免反復(fù)凍融。
8.試劑六:試劑放于棕色瓶內(nèi)玻璃瓶中,臨用前加入12mL蒸餾水;可分裝后-20℃保存4周,避免反復(fù)凍融。
9.工作液的配制:臨用前根據(jù)樣本量按試劑三稀釋液:試劑四稀釋液:試劑五:試劑六=50μL:50μL:200μL:200μL(共500μL,約1T)的比例配制,現(xiàn)配現(xiàn)用。
產(chǎn)品說明:
乙酰輔酶羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶羧化生成丙二酰輔酶,是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
ACC能夠催化乙酰輔酶、NaHCO3和ATP生成丙二酰輔酶、ADP和無機磷,丙 酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一
步依次催化NADH生成NAD+,在340nm下測定NADH下降速率,即可反映ACC活性。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計、分析天平、低溫離心機、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、漩渦震蕩儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、蒸餾水和冰。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參文獻)
1、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿,然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
2、細菌或細胞:收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(106個):提取液體積(mL)為5~10:1的比例(建議5百萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300W,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3、血清(漿):直接測定。
二、測定步驟
1、 分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 臨用前根據(jù)樣本量將試劑一和工作液預(yù)熱5min。
3、 操作表:(在1mL石英比色皿/1.5mL離心管中依次加入下列試劑)
試劑名稱(µL) | 測定管 | 空白管 |
試劑一 | 250 | 250 |
樣本 | 50 | - |
蒸餾水 | - | 50 |
工作液 | 500 | 500 |
試劑二 | 200 | 200 |
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三、ACC活性計算
1. 按樣本蛋白濃度計算:
酶活定義:每毫克組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol NADH轉(zhuǎn)化為1nmol NAD+為一個酶活單位。
ACC活性(U/mg prot)=[?A×V反總÷(?×d)×109]÷(Cpr×V樣)÷T=321.5×?A÷Cpr
2. 按樣本質(zhì)量計算:
酶活定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol NADH轉(zhuǎn)化為1nmol NAD+為一個酶活單位。
ACC酶活(U/g 質(zhì)量)=[?A×V反總÷(?×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=321.5×?A÷W
3. 按照細菌或細胞數(shù)量計算:
酶活定義:每106個細菌或細胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol NADH轉(zhuǎn)化為1nmol NAD+為一個酶活單位。
ACC酶活(U/106 cell)=[?A×V反總÷(?×d)×109]÷(N×V樣÷V樣總)÷T =321.5×?A÷N
4. 按血清(漿)體積計算:
酶活定義:每mL液體在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol NADH轉(zhuǎn)化為1nmol NAD+為一個酶活單位。
ACC酶活(U/mL)=[?A×V反總÷(?×d)×109]÷V樣÷T=321.5×?A
V反總:反應(yīng)體系總體積,1×10-3L;?:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d:1mL石英比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,10min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,蛋白濃度自行測定;W:樣本質(zhì)量,g;N:細菌或細胞數(shù)量,以106計;109:單位換算系數(shù),1mol=109nmol。
注意事項:
1、 比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃,取小燒杯一只裝入一定量的37℃蒸餾水,將此燒杯放入37℃水浴鍋
中,在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
2、 最好兩個人同時做此實驗,一個人比色,一個人計時,以保證實驗結(jié)果的準確性。
3、 當A1測定空白時,建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定;當樣本?A過小時,建議增大樣本量或延長反應(yīng)時間,注意同步修改計算公式。
4、 由于提取液一中含有蛋白(約1mg/mL),若需要測定樣本的蛋白濃度,需要減去提取液本身的蛋白濃度。
實驗實例:
1. 取0.1044g小鼠腦組織,加入1mL提取液,進行勻漿、離心、取上清,之后按照測定步驟操作,用1mL石英比色皿測得計算ΔA=(A1測定-A2測定)-(A1空白-A2空白)=(1.520-0.229)-(1.489-1.456)=1.258,按樣本質(zhì)量計算酶活得:
ACC酶活(U/g 質(zhì)量)=321.5×?A÷W=3874.01 U/g 質(zhì)量。
2. 取0.1041g向日葵葉片組織,加入1mL提取液,進行勻漿、離心、取上清,之后按照測定步驟操作,用1mL石英比色皿測得計算ΔA=(A1測定-A2測定)-(A1空白-A2空白)=(1.477-1.374)-(1.489-1.456)=0.070,按樣本質(zhì)量計算酶活得:
ACC酶活(U/g 質(zhì)量)=321.5×?A÷W=216.19 U/g 質(zhì)量。
3. 取3×106個Raw細胞,加入1mL提取液,進行勻漿、離心、取上清,之后按照測定步驟操作,用1mL石英比色皿測得計算ΔA=(A1測定-A2測定)-(A1空白-A2空白)=(1.464-1.255)-(1.489-1.456)=0.176,按細胞數(shù)量計算酶活得:
ACC酶活(U/106 cell)=321.5×?A÷N=18.86 U/106 cell。
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BC0750/BC0755 乙醛脫氫酶(ALDH)活性檢測試劑盒
乙酰輔酶羧化酶活性檢測試劑盒 脂肪酸 乙酰輔酶羧化酶活性檢測試劑盒 脂肪酸