輔酶II NADP(H)含量檢測(cè)試劑盒（MTT顯色法）說(shuō)明書
可見分光光度法
貨號(hào)：BC1100
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入6mL蒸餾水充分混勻，溶解后2-8℃保存4周。

2. 試劑四：臨用前將試劑四A溶解到試劑四B中，溶解后分裝保存，避免反復(fù)凍融，-20℃保存4周。

3. NADP標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入 1.27 mL 蒸餾水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存2周。

4. NADPH標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入 1.2 mL 蒸餾水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存2周。

產(chǎn)品說(shuō)明：
輔酶Ⅱ NADP(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NADP⁺和 NADPH 含量測(cè)定可以計(jì)算 NADP（NADPH + NADP⁺)含量和 NADPH/NADP⁺比值，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP⁺比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一，而且在PPP途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NADP⁺和NADPH。NADPH通過(guò)PMS的遞氫作用，使氧化型噻唑藍(lán)（MTT）還原為甲瓚，570nm下檢測(cè)吸光值，從而測(cè)定 NADPH 含量。利用6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原NADP⁺為NADPH，從而檢測(cè)NADP⁺含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、研缽/勻漿器、超聲破碎儀、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件

注意事項(xiàng)：

1. 如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三按比例配成混合液。

2. 反應(yīng)過(guò)程中注意避光。

3. 由于每一個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管，本試劑盒50管可以測(cè)定24個(gè)NADP⁺或NADPH。

1. 如果測(cè)定吸光值超過(guò)線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

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2. NADP⁺的測(cè)定：稱取 0.1g 綠蘿葉片，按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作，玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定= A₂- A₁=0.092-0.036=0.056，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₁=0.531x+0.0266，根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.055，NADP⁺含量得：NADP⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=0.55 nmol/g 質(zhì)量。

3. 
   

NADPH的測(cè)定：稱取 0.1g 綠蘿葉片，按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作，玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照= A₂’- A₁’=0.046-0.012=0.034，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₂=0.332x+0.0136，根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=0.061，NADPH含量得：NADPH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=0.614 nmol/g 質(zhì)量。

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2. NADP⁺的測(cè)定：稱取 0.1g 大兔肝臟，按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作，玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定= A₂- A₁=0.217-0.108=0.109，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₁=0.531x+0.0266，根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.155，NADP⁺含量得：NADP⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=1.55 nmol/g 質(zhì)量。

3. 
   

NADPH的測(cè)定：稱取0.1g 大兔肝臟，按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作，玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照= A₂’- A₁’=0.085-0.008=0.077，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₂=0.332x+0.0136，根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=0.191，NADPH含量得：NADPH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=1.91 nmol/g 質(zhì)量。

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2. NADP⁺的測(cè)定：取0.1mL馬血清，按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作，玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定= A₂- A₁=0.055-0.026=0.029，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₁=0.531x+0.0266，根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.005，NADP⁺含量得：NADP⁺ （nmol/mL）= 11 x₁=0.050 nmol/mL。

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NADPH的測(cè)定：取0.1mL馬血清，按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作，玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照= A₂’- A₁’=0.028-0.012=0.016，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₂=0.332x+0.0136，根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=0.007，NADPH含量得：NADPH（nmol/mL）=11 x₂=0.080 nmol/mL。
標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋表
NADP⁺標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表                                      NADPH 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表

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