磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC3315

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入15 mL試劑一溶解?？扇芙夂蠓盅b-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑三：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管內(nèi)。臨用前加入蒸餾水按體積比1：120稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3、 試劑四：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管內(nèi)。臨用前加入蒸餾水按體積比7：250稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。

4、 試劑五：粉劑置于試劑瓶內(nèi)玻璃管內(nèi)。臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解；可溶解后分裝-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

5、 工作液的配制：將試劑二、試劑三、試劑四按7:1:1（V:V:V）的比例配制工作液，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

PEPCK（EC 4.1.1.32）廣泛存在于動物、開花植物、藻類、部分真菌和細(xì)菌中。該酶催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸，是調(diào)節(jié)糖異生途徑的第一限速酶。

PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心10min，取上清，置冰上待測。 

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

血清（漿）樣本：直接檢測。

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將工作液置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱5分鐘。

3、 操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列試劑：

三、PEPCK酶活計算

A 按微量石英比色皿計算：

1、 按蛋白濃度計算

酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 3215.4×ΔA÷Cpr

2、 按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK酶活（U/g 質(zhì)量）= ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T=3215.4×ΔA÷W

3、 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK酶活（U/10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（500×V樣÷V樣總）÷T=6.43×ΔA

4、 按血清（漿）體積計算

酶活定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK（U/mL）＝ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷V樣÷T=3215.4×ΔA

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.0002L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量，g，T：反應(yīng)時間：1min；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

B 按96孔UV板計算：

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計算即可。

注意事項：

1、 當(dāng)A1小于1或ΔA大于0.6時（96孔UV板是當(dāng)A1小于0.6或ΔA大于0.4時），建議將樣本稀釋適當(dāng)倍數(shù)后再進(jìn)行測定，以提高檢測靈敏度。

2、 酶活性高的樣本如動物肝、腎等組織，建議將提取液稀釋5倍或5倍以上測定。

3、 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，變化不超過0.06。

4、 加樣、混勻等步驟要迅速，秒表計時要準(zhǔn)確。

實驗實例：

1、 取0.1g肝臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清后再用提取液稀釋2倍，之后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.1298-0.4464=0.6834，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.3819-1.3463=0.0356，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.6834-0.0356=0.6478，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

PEPCK酶活（U/g質(zhì)量）= 3215.4×ΔA÷W×2（稀釋倍數(shù)）=3215.4×0.6478÷0.1×2=41658.72 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1g蘆薈加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.4015-1.2665=0.135，ΔA空白管= A1空白-A2空白=1.3819-1.3463=0.0356，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.135-0.0356=0.0994，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

PEPCK酶活（U/g質(zhì)量）= 3215.4×ΔA÷W=3215.4×0.0994÷0.1=3196.108 U/g 質(zhì)量。

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