腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
紫外分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。
貨號(hào)：BC0430
規(guī)格：25T/12S、50T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

25T溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前將試劑二A加入5mL試劑二B充分溶解，用不完的試劑建議-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

2. 試劑三：臨用前取1支加1.5 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑建議-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

3. 試劑四：臨用前加入500 μL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑-20℃分裝保存四周，避免反復(fù)凍。

4. 試劑五：臨用前加入500 μL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑-20℃分裝保存四周，避免反復(fù)凍。

50T溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取1瓶試劑二A加入5mL試劑二B充分溶解，用不完的試劑建議-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

2. 試劑三：臨用前取1瓶加3 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑建議-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

3. 試劑四：臨用前取1支加入500 μL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

4. 試劑五：臨用前取1支加入500μL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說(shuō)明：
AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）與ATP反應(yīng)生成淀粉合成的直接前體ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。
AGP催化的逆向反應(yīng)生成G-1-P，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下測(cè)定NADPH增加速率，即可計(jì)算AGP活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
稱(chēng)取約0.1g組織加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟

1. 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 在EP管中按順序加入下列試劑

迅速混勻后在340nm波長(zhǎng)下測(cè)定10s吸光值A1和130s吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
三、AGP活性計(jì)算

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活性單位。
AGP活性（U/mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷T÷（Cpr×V樣本）=380.5×ΔA÷Cpr
（此法需要自行測(cè)定粗酶液蛋白質(zhì)濃度）

1. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
AGP活性（U/g 質(zhì)量）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷T÷（W×V樣本÷V提?。?span style="font-family: Times New Roman, Times, serif">=380.5×ΔA÷W
T：反應(yīng)時(shí)間，15min；ε：NADPH消光系數(shù)，6.22×10^-3mL/nmol/cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.71mL；d：石英比色皿光程，1cm；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.02mL；V提?。杭尤氲奶崛∫后w積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g。
注意事項(xiàng)：
如果一次性測(cè)定樣本較多，可將試劑一、二按比例配成混合液1，將試劑一、三、四和五按比例配成混合液2。
若測(cè)定數(shù)值較小，可以加大樣本量或者延長(zhǎng)第二步反應(yīng)時(shí)間。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g柳樹(shù)葉片加入1mL提取液冰浴中勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清置冰上，之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA=A2-A1=0.55-0.491=0.059，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：AGP活性（U/g 質(zhì)量）=380.5×ΔA÷W=224.495 U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

1. Baroja-Fernández E, Zandueta-Criado A, Rodr??guez-López M, et al. Distinct isoforms of ADPglucose pyrophosphatase and ADPglucose pyrophosphorylase occur in the suspension-cultured cells of sycamore (Acer pseudoplatanus L)[J]. FEBS letters, 2000, 480(2-3): 277-282.

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