果糖-1,6-二磷酸（FDP）含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。

貨號(hào)：BC2245

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一支加入0.15 mL蒸餾水，充分溶解后待用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1176 μL 蒸餾水充分溶解，配制成50 μmol/mL果糖-1,6-二磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，2-8℃可以保存4周。

產(chǎn)品說(shuō)明：

果糖1,6-二磷酸（fructose-1,6-diphosphate, FDP）是糖酵解過(guò)程中的一種重要的中間產(chǎn)物，對(duì)多種酶具有調(diào)節(jié)作用，具有改善細(xì)胞能量代謝、增加能量利用、抗心律失常及抗組織過(guò)氧化等作用，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)藥。

醛縮酶催化果糖1,6-二磷酸裂解，產(chǎn)物與2,4-二* 苯 肼在酸性介質(zhì)中反應(yīng)生成2,4-二*苯腙，在堿性溶液中呈紅棕色，在540 nm處有特征吸收峰。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰、蒸餾水和EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 將50µmol/mL的果糖-1,6-二磷酸標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水倍比稀釋為3.125、1.5625、0.78125、0.39、0.2、0.1 µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表：

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需40µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4、 樣本測(cè)定：(在1.5 mL離心管或96孔板中操作)

三、FDA含量計(jì)算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y= kx+b，將ΔA帶入方程得到x（µmol/mL）。

2、FDP含量的計(jì)算：

（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

FDP含量（µg/g 質(zhì)量）=x×(V上清+V提取液二)×M÷(W×V上清÷V提取液一)=403.75x÷W

（2）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

FDP含量（µg/10⁴ cell）=x×(V上清+V提取液二)×M÷(V上清÷V提取液一×N)=403.75x÷N

（3）按液體體積計(jì)算

FDP含量（µg/mL）=x×（V上清+V提取液二）×M÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]=4441.25x

V上清：提取時(shí)上清液體積，0.8mL；V提取液二：提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：提取液一的體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；M：果糖-1,6-二磷酸分子質(zhì)量，340；V液體：液體樣本體積，0.1mL；N：細(xì)胞數(shù)量，以萬(wàn)計(jì)。

注意事項(xiàng)：

當(dāng)ΔA測(cè)定大于0.5時(shí)，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

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