脂蛋白酯酶（LPL）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC2445

規(guī)格：100T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入1mL丙酮溶解備用，用不完的試劑-20℃保存4周。

2. 標準品：5 μmol/mL對硝基苯*標準溶液。臨用前取30μL 5μmol/mL標準液，加入450μL試劑一，充分混勻，配制成0.3125μmol/mL標準液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配（實驗中每管需要30μL，為減小實驗誤差，故配制大體積）。

產品說明：

脂蛋白酯酶（Lipoproteinlipase，LPL）是甘油三酯降解的降速酶，可催化甘油三酯水解為脂肪酸和單酸甘油酯，主要在肝臟實質細胞中合成，在脂質代謝和轉運中發(fā)揮重要作用。

脂蛋白酯酶水解4-硝基苯棕櫚酸酯產生4-硝基苯*，在400nm有特征吸收峰。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫臺式離心機、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、EP管、冰、丙酮和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：試劑一體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣本：直接檢測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至400nm，蒸餾水調零。

2、 操作表：在1.5mL EP管中進行下列操作：

三、LPL活性計算

1、血清（漿）LPL活力計算

單位定義：在45℃，pH7.5條件下，每毫升血清每分鐘水解產生1nmol 4-硝基苯*為一個酶活力單位。

LPL（U/mL）=ΔA÷（ΔA標準÷C標準）÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA標準

2、組織、細菌或細胞中LPL活力計算

（1）按樣本質量計算

單位定義：在45℃，pH7.5條件下，每克組織每分鐘水解產生1nmol 4-硝基苯*為一個酶活力單位。

LPL（U/g 質量）=ΔA÷（ΔA標準÷C標準）×V提取÷W÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA標準÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：在45℃，pH7.5條件下，每毫克蛋白每分鐘水解產生1nmol 4-硝基苯*為一個酶活力單位。

LPL（U/mg prot）=ΔA÷（ΔA標準÷C標準）×V提取÷（V提取×Cpr）÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA標準÷Cpr

（3）按細菌或細胞數(shù)量計算：

單位定義：在45℃，pH7.5條件下，每10⁴個細胞每分鐘水解產生1nmol 4-硝基苯*為一個酶活力單位。

LPL（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ΔA標準÷C標準）×V提取÷N÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA標準÷N

C標準：標準溶液濃度，0.3125μmol/mL；V提?。杭尤朐噭┮惑w積，1mL；T：反應時間，10min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細菌或細胞總數(shù)，以萬計；1000：單位換算系數(shù)，1μmol=1000nmol。

注意事項：

1、 測定管加入試劑二后混變渾濁為正?，F(xiàn)象。

2、 若A大于2，將粗酶液用試劑一稀釋后再進行測定。

實驗實例：

1、 取0.1g大鼠肌肉加入1mL試劑一，取上清后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA=A測定管- A對照管=0.367-0.128=0.239，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.378-0.046=0.332，按樣本質量計算酶活得：

LPL（U/g 質量）= 31.25×ΔA÷ΔA標準÷W=31.25×0.239÷0.332÷0.1=224.96 U/g 質量。

2、 取兔血清直接按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA=A測定管- A對照管=0.750-0.152=0.598，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.378-0.046=0.332，按血清（漿）體積計算酶活得：

LPL（U/mL）=31.25×ΔA÷ΔA標準=31.25×0.598÷0.332=56.29 U/mL。

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