糖化酶活性檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號(hào)：BC2675

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前取1瓶加入10 mL提取液，充分混勻后沸水浴直至溶解（約10min），2-8℃保存4周； 

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg無水葡*糖，臨用前加1 mL提取液溶解為10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品備用，2-8℃保存兩周； 

產(chǎn)品說明：

糖化酶，即葡萄糖淀*酶（EC3.2.1.3），又稱γ-淀*酶。糖化酶是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶，主要作用是從淀粉、糊精、糖原等碳鏈上的非還原性末端依次水解α-1,4糖苷鍵，切下一個(gè)個(gè)葡萄糖單元，對(duì)于支鏈淀粉，當(dāng)遇到分支點(diǎn)時(shí)，它也可以水解α-1,6糖苷鍵由此將支鏈淀粉全部水解成葡萄糖。多應(yīng)用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有機(jī)酸，甘油，淀粉糖等工業(yè)中，是我國重要的工業(yè)酶制劑之一。

糖化酶將可溶性淀粉生成葡萄糖，堿性條件下，葡萄糖與3,5-二硝基水楊酸共熱后生成紅棕色化合物，在540nm處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)葡萄糖的量與反應(yīng)液顏色深淺成正比，以此測(cè)定糖化酶的活力。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀 、微量玻璃比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、研缽/勻漿器，超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清

置于冰上待測(cè)。

3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。（若有沉淀則離心后測(cè)定）

二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：將標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋至2、1.5、1.0、0.8、0.4、0.2、0.1mg/mL。

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需15µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3. 吸取50μL樣本于1.5mLEP管中沸水浴5min作為對(duì)照管的滅活樣本。

4. 加樣表：

三、糖化酶活性計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，mg/mL）和吸光度ΔA標(biāo)（y，ΔA標(biāo)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測(cè)（y，ΔA測(cè)）帶入公式計(jì)算樣本濃度（x，mg/mL）。

2. 酶活性計(jì)算：

（1）按照蛋白濃度計(jì)算：

酶活性定義：在40℃每毫克蛋白每小時(shí)產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/mg prot）=x×V樣總÷（V樣總×Cpr）÷T=3x÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃每克組織每小時(shí)產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/g 質(zhì)量）= x×V樣總÷ W÷T=3x÷W

（3）按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：在40℃每毫升液體每小時(shí)產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/mL）= x×V樣÷V樣÷T=3x

（4）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃每10⁴個(gè)細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

糖化酶活性（U/10⁴ cell）= x×V樣總÷500÷T=0.006x

V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，15μL=0.015mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，需自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min=0.333h；500：細(xì)胞數(shù)量，500萬。

注意事項(xiàng)：

測(cè)定之前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，若吸光值較高，請(qǐng)將樣本用提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屧贉y(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g玉蘭葉片加入1mL提取液冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上，之后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.501-0.396=0.105，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.488x-0.003，計(jì)算x=0.221，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

糖化酶活性（U/g 質(zhì)量）=3x÷W=6.64 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1g肝臟加入1mL提取液冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上，之后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)=A測(cè)定管-A對(duì)照管=1.006-0.858=0.148，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.488x-0.003，計(jì)算x=0.309，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

糖化酶活性（U/g 質(zhì)量）=3x÷W=9.27 U/g 質(zhì)量。

3、 取兔血清按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)=A測(cè)定管-A對(duì)照管=1.045-0.481=0.564，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.488x-0.003，計(jì)算x=1.162，按照液體體積計(jì)算：

糖化酶活性（U/mL）=3x=3.486 U/mL。

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