脂肪酸合成酶（FAS）活性檢測試劑盒說明書

微量

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC0555

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前取一支加入1 mL試劑三，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存2周，禁止反復(fù)凍融。

2. 試劑二：臨用前取一支加入1 mL試劑三，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存2周，禁止反復(fù)凍融。

3. 試劑四：臨用前取一支加入0.5 mL試劑三，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存2周，禁止反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：

脂肪酸合成酶（Fatty acid synthetase，FAS）是一種關(guān)于脂肪酸再生能力并起重要作用的限速酶，它通過催化丙二酰輔*A、乙酰輔*A和NADPH生成長鏈脂肪酸和NADP+，NADPH在340nm條件下有特征吸收峰。通過檢測340nm條件下吸光值的下降速率，可以計(jì)算出FAS活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器/超聲波細(xì)胞破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、細(xì)菌、細(xì)胞樣本的制備：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）: 提取液體積（mL）為500~1000 : 1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300W，超聲3秒，間隔9秒，總時(shí)間5 min）；于4℃，

12000 g離心20 min，取上清液，置于冰上待測。

2、組織樣本的制備：按照質(zhì)量（g）: 提取液體積(mL)為1: 5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1mL

提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，12000 g離心20 min，取上清液，置于冰上待測。

3、血清（漿）等液體樣本：直接測定

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑三臨用前置于37℃保溫15min。

3、 加樣表（在96孔UV板或者微量石英比色皿中加入下列試劑）

三、FAS活性計(jì)算

a. 使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

單位定義：在37℃條件下，每毫克蛋白每分鐘氧化1 nmol NADPH為1個(gè)酶活單位。

FAS (U/mg prot) =[ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹] ÷(Cpr×V樣)÷T=1607.7×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：在37℃條件下，每克組織每分鐘氧化1 nmol NADPH為1個(gè)酶活單位。

FAS (U/g 質(zhì)量) =[ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1607.7×ΔA ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

單位定義：在37℃條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1 nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。

FAS (U/10⁴ cell) =[ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹]÷(N×V樣÷V樣總)÷T=1607.7×ΔA ÷N

（4）按液體體積計(jì)算

單位定義：在37℃條件下，每毫升樣本每分鐘氧化1 nmol NADPH為 1個(gè)酶活單位。

FAS (U/mL) =[ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹]÷V樣÷T=1607.7×ΔA

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20 μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；N：細(xì)胞數(shù)量，萬個(gè)（以萬計(jì)）；10⁹：換算系數(shù)，1mol=10⁹ nmol。

b.  使用96孔UV板測定的計(jì)算公式

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

單位定義：在37℃條件下，每毫克蛋白每分鐘氧化1 nmol NADPH為1個(gè)酶活單位。

FAS (U/mg prot) =[ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹] ÷(Cpr×V樣)÷T=2679.5×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：在37℃條件下，每克組織每分鐘氧化1 nmol NADPH為1個(gè)酶活單位。

FAS (U/g 質(zhì)量) =[ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=2679.5×ΔA ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

單位定義：在37℃條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1 nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。

FAS (U/10⁴ cell) =[ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹]÷(N×V樣÷V樣總)÷T=2679.5×ΔA ÷N

（4）按液體體積計(jì)算

單位定義：在37℃條件下，每毫升樣本每分鐘氧化1 nmol NADPH為 1個(gè)酶活單位。

FAS (U/mL) =[ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹]÷V樣÷T=2679.5×ΔA

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板，0.6 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200 μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20 μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；N：細(xì)胞數(shù)量，萬個(gè)（以萬計(jì)）；10⁹：換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

注意事項(xiàng)：

1、提取液中含有BSA（約2mg/mL），測定上清液蛋白濃度時(shí)需要減去提取液中蛋白濃度。

2、如果測定吸光值＞1.5或ΔA＞0.5，建議用蒸餾水稀釋樣本后再進(jìn)行測定，計(jì)算公式中乘稀釋倍數(shù)。如果測定吸光值較小，建議加大樣本量后再進(jìn)行測定。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

取0.1 g小鼠肝臟加入1 mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。12000 g 4℃離心20 min，取上清置冰上，之后用石英微量比色皿按照測定步驟操作，測得計(jì)算ΔA =（A1測定-A2測定）-（A1空白-A2空白）= （1.1783-1.0945）-（0.5653-0.5593）=0.0778，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

FAS(U/g 質(zhì)量)  =1607.7×ΔA ÷W=1251 U/g質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Robinson J D, Bradley R M, Brady R O. Biosynthesis of Fatty Acids[J]. Journal of Biological Chemistry, 1960, 238(2).

[2] Tcl B. Purification and crystallization of rat liver fatty acid synthetase[J]. Archives of Biochemistry & Biophysics, 1981, 209(2):613-619.

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