線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/NADH-CoQ還原酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。
貨號(hào)：BC0515
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取一支加入1 mL丙 酮，充分溶解，2-8℃可保存1個(gè)月（1瓶粉劑即可做100T，為延長(zhǎng)試劑盒使用時(shí)間，故此產(chǎn)品多給一支）；

2. 試劑三：臨用前加入0.1mL 丙 酮，丙 酮易揮發(fā)，使用完畢后注意封口，-20℃可保存2個(gè)月；

3. 試劑三工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑三：丙 酮=5μL：0.5mL（約50T）混合備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；

4. 試劑四：臨用前取一支加入1.6mL蒸餾水（約100T），充分溶解，-20℃可保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融（1瓶粉劑即可做100T，為延長(zhǎng)試劑盒使用時(shí)間，故此產(chǎn)品多給一支）；

5. 工作液的配制：根據(jù)用量將丙 酮：試劑二：試劑三工作液=250μL：250μL：500μL（約50T）混合備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明：
復(fù)合體Ⅰ（EC 1.6.5.3）又稱NADH-CoQ還原酶或NADH脫氫酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是線粒體內(nèi)膜中最大的蛋白復(fù)合物。該酶催化一對(duì)電子從NADH傳遞給CoQ，同時(shí)可使O₂還原生成O^2-，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生O^2-的主要部位。測(cè)定該酶活性，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態(tài)，而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態(tài)。
復(fù)合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成NAD⁺，在340nm下測(cè)定NADH的氧化速率計(jì)算出該酶活性的大小。


注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/ 96孔UV板、研缽/勻漿器、細(xì)胞超聲破碎儀、丙 酮、冰和蒸餾水。

操作步驟：具體操作步驟詳見(jiàn)“產(chǎn)品資料"附件
注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測(cè)定的吸光值過(guò)高（A1高于1.5），可用蒸餾水稀釋上清液后再測(cè)定。計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA大于0.4，需將樣本稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）；若ΔA偏小，則可以通過(guò)增加加入的樣本體積來(lái)提高靈敏度。

2. 樣本蛋白濃度需自行測(cè)定。由于提取液一中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測(cè)定樣本蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量（約0.5mg/mL）。

3. 推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活。另附按樣本計(jì)算公式和按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算公式

4. 附：使用樣本重量計(jì)算公式：（樣本檢測(cè)數(shù)為100T/48S） 

A、上清中復(fù)合體I活力的計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體I活性（U/g質(zhì)量）= [ΔA1×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=3215.43×ΔA1÷W
B、沉淀中復(fù)合體I活力的計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體I活性（U/g質(zhì)量）= [ΔA2×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V重懸×V樣)÷T=1286.17×ΔA2÷W
ΔA1：上清測(cè)定值；ΔA2：沉淀測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提取：加入提取液一體積，1mL；V重懸：沉淀重懸體積（0.2mL提取液一+0.2mL提取液二），0.4mL；V樣：加入樣本體積，0.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；W：樣本質(zhì)量，g；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。  
C、樣本復(fù)合體I總活力的計(jì)算：
樣本復(fù)合體I總活力即為上清中復(fù)合體I活力與沉淀中復(fù)合體I活力之和。
按樣本質(zhì)量計(jì)算：復(fù)合體I（U/g 質(zhì)量）=3215.43×ΔA1÷W+1286.17×ΔA2÷W
D、以96孔板計(jì)算：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm進(jìn)行計(jì)算即可。

1. 附：使用細(xì)胞數(shù)量計(jì)算公式：（樣本檢測(cè)數(shù)為100T/48S） 

1. 上清中復(fù)合體I活力的計(jì)算：

單位的定義：每10⁶個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體I活性（U/10⁶ cell）= [ΔA1×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V提取×V樣)÷T =3215.43×ΔA1÷N

1. 沉淀中復(fù)合體I活力的計(jì)算:

單位的定義：每10⁶個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體I活性（U/10⁶ cell）= [ΔA2×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V重懸×V樣)÷T=1286.17×ΔA2÷W
ΔA1：上清測(cè)定值；ΔA2：沉淀測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提?。杭尤胩崛∫阂惑w積，1mL；V重懸?。撼恋碇貞殷w積（0.2mL提取液一+0.2mL提取液二），0.4mL；V樣：加入樣本體積，0.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；N：細(xì)胞數(shù)量，以10⁶計(jì)；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

1. 樣本復(fù)合體I總活力的計(jì)算：

樣本復(fù)合體I總活力即為上清中復(fù)合體I活力與沉淀中復(fù)合體I活力之和。
復(fù)合體I總活性（U/10⁶ cell）=3215.43×ΔA1÷N +1286.17×ΔA2÷N
D、以96孔板計(jì)算：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm進(jìn)行計(jì)算即可。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Huazhang Zhu,Weizhen Zhang,Yingying Zhao,et al. GSK3β-mediated tau hyperphosphorylation triggers diabetic retinal neurodegeneration by disrupting synaptic and mitochondrial functions. Molecular Neurodegeneration. November 2018.

2. Liuqin He,Haiwen Zhang, Xihong Zhou. Weanling Offspring of Dams Maintained on Serine-Deficient Diet Are Vulnerable to Oxidative Stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. September 2018.

3. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018.

4. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

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6. OuYang Q, Tao N, Zhang M. A damaged oxidative phosphorylation mechanism is involved in the antifungal activity of citral against Penicillium digitatum[J]. Frontiers in microbiology, 2018, 9: 239.

參考文獻(xiàn)：

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2. Eike L, Jakob M C, Julian D L, et al. Conformational changes in mitochondrial complex I from the thermophilic eukaryote Chaetomium thermophilum [J]. Science Advances, 2022, 8(47): 419-429.

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