L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（Gal LDH）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
可見(jiàn)分光光度法
貨號(hào)：BC1250
規(guī)格：50T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前加入40 mL蒸餾水，充分溶解；

2. 試劑二：臨用前加入5 mL蒸餾水，充分溶解。

產(chǎn)品說(shuō)明：
L-半乳糖途徑是合成AsA的主要途徑。Gal LDH位于線粒體內(nèi)膜，負(fù)責(zé)催化植物體內(nèi)AsA生物合成的最后一步，也是該途徑的關(guān)鍵酶之一，對(duì)植物體內(nèi)AsA含量的積累起著至關(guān)重要的作用。
Gal LDH催化L-半乳糖內(nèi)酯還原氧化型細(xì)胞*素c（Cyt c），還原型Cyt c在550nm有吸收峰；測(cè)定還原型Cyt c增加速率，來(lái)計(jì)算Gal LDH活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
臺(tái)式離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
稱取約0.1g樣本，加提取液1mL，冰上充分研磨，13000g 4℃離心10min，取上清液置冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到550nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 按樣本數(shù)取出一定量的試劑一在25℃水浴鍋中預(yù)熱30min以上，其余的分裝保存(-20℃)。

3. 空白管：依次在1mL比色皿中加入100μL蒸餾水、800μL預(yù)熱的試劑一和100μL試劑二，迅速混勻后于550nm比色，記錄10s和130s的吸光值，分別為A1，A2，ΔA空白管=A2-A1。

4. 測(cè)定管：依次在1mL比色皿中加入100μL上清液、800μL預(yù)熱的試劑一和100μL試劑二，迅速混勻后于550nm比色，記錄10s和130s的吸光值，分別為A3，A4，ΔA測(cè)定管=A4-A3。

三、Gal LDH活性計(jì)算
（1）按蛋白濃度計(jì)算
Gal LDH活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原1μmol Cyt c為1個(gè)酶活單位。


Gal LDH (U/mg prot) = [(ΔA測(cè)定管-ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷（Cpr×V樣）÷T
=0.289×(ΔA測(cè)定管-ΔA空白管) ÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
Gal LDH活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原1μmol Cyt c為1個(gè)酶活單位。
Gal LDH（U/g 質(zhì)量）=[(ΔA測(cè)定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反總×10⁶]÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=0.289×(ΔA測(cè)定管-ΔA空白管) ÷W
ε：還原型Cyt c摩爾消光系數(shù)，17.3×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL=0.001L；10⁶：單位換算系數(shù)，1mol=1×10⁶μmol；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。
注意事項(xiàng)：
1、在測(cè)定酶活時(shí)要注意溫度。建議取小燒杯一只裝入一定量的25℃蒸餾水，將此燒杯放入25℃水浴鍋中，在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
2、建議兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
3、加入最后一種試劑后需迅速混勻并測(cè)定OD值。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g獼猴桃加入1mL提取液冰上充分研磨，13000g 4℃離心10min，取上清液置冰上，按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管=A4-A3=0.881-0.784=0.097，ΔA空白管=A2-A1=0，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

Gal LDH（U/g 質(zhì)量）=0.289×(ΔA測(cè)定管-ΔA空白管) ÷W=0.2803 U/g 質(zhì)量。
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