目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測(cè)試劑盒-常量法>> BC3860Caspase-6活性測(cè)定試劑盒 常量法
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更新時(shí)間:2024-04-24 13:16:08瀏覽次數(shù):1476評(píng)價(jià)
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CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
---|---|---|---|
分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 20T 50T 100T |
貨號(hào) | BC3860 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
主要用途 | Caspase-6活性測(cè)定 |
Caspase-6活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
比色法
貨號(hào):BC3860
規(guī)格:20T、50T、100T
產(chǎn)品組成:使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱/規(guī)格 | 20T | 50T | 100T | 保存條件 |
試劑一 | 液體20 mL×1瓶 | 液體20 mL×1瓶 | 液體25 mL×1瓶 | -20℃保存 |
試劑二 | 液體30 mL×1瓶 | 液體60 mL×1瓶 | 液體120 mL×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體0.25 mL×1支 | 液體0.55 mL×1支 | 液體0.55 mL×2支 | -20℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 液體1mL×1支 | 液體1 mL×1支 | 液體1 mL×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制:
1、 試劑一:分裝-20℃保存。
2、 試劑二:分裝-20℃保存。
3、 標(biāo)準(zhǔn)品:pNA標(biāo)準(zhǔn)溶液,5 mmol/L。標(biāo)準(zhǔn)溶液在4℃條件下為渾濁狀態(tài),溶解即可變?yōu)槌吻鍫顟B(tài),不影響使用。
4、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制:取9 mL試劑一加入1 mL試劑二,充分混勻待用。(也可按照試劑一:試劑二=9:1的比例,自行配制)。
產(chǎn)品說(shuō)明:
Caspase是參與細(xì)胞凋亡過(guò)程的蛋白酶家族,包含10多個(gè)成員。Caspase-6也稱Mch-2,其前體蛋白被granzyme B剪切后形成活化的caspase-6二聚體,可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-6可剪切凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白PARP,剪切核膜上關(guān)鍵蛋白Lamin A,其對(duì)于Lamin A的識(shí)別位點(diǎn)是VEID。
本試劑盒測(cè)定原理基于Caspase-6特異水解其多肽底物Ac-VEID-pNA (N-acetyl-Val-Glu-Ile-Asp-p-nitroanilide),釋放出游離的硝基苯胺pNA,后者呈黃色在405 nm具有最大吸收峰,采用可見(jiàn)光光度比色法測(cè)定。其吸光度值對(duì)應(yīng)于Caspase-6的水解活性。
注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、100μL玻璃比色皿/96孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))
1、培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)胞數(shù)量(約106個(gè))加100 μL試劑二(若裂解不充分可提高至150-200 μL),震蕩重懸沉淀,置冰上靜置15 min,4℃,15000g離心10-15min,取上清置冰上待測(cè)。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑二體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1 g組織,加入1 mL試劑二),冰浴研磨或充分剪碎,置冰上靜置15 min,4℃,15000g離心10-15min,取上清置冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟
1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 臨用前用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將5 mmol/L pNA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至200、100、50、25、12.5、0μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。
3、 樣本測(cè)定(在96孔板/EP管中按順序加入以下試劑)
試劑名稱(μL) | 測(cè)定管 | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 |
試劑一 | 40 | 40 | |
樣本 | 50 | ||
試劑二 | 50 | ||
試劑三 | 10 | 10 | |
標(biāo)準(zhǔn)溶液 | 100 | ||
混勻,蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37℃孵育60-120分鐘。發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)即可測(cè)定405nm處吸光值。如果顏色變化不明顯,可以適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間,甚至可以孵育過(guò)夜。空白管只需做1-2次。計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定管-A空白管。 | 立即測(cè)定405nm下吸光度 |
三、Caspase-6活性計(jì)算
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度(x,μmol/L)和ΔA標(biāo)準(zhǔn)(y,減去濃度為0的空白管)做標(biāo)準(zhǔn)方程。將ΔA測(cè)定代入標(biāo)準(zhǔn)方程得到x(μmol/L)。
2. 按酶活性增加百分比計(jì)算
Caspase-6活性增加百分比=(實(shí)驗(yàn)處理組A測(cè)定-A空白管)/(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組A測(cè)定-A空白管)×100%
該方法簡(jiǎn)單可靠,可粗略反應(yīng)酶活性情況。
3. 按酶活計(jì)算
參考Chemicon公司的caspase酶活力單位的定義:One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一個(gè)酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí),在37℃一個(gè)小時(shí)內(nèi)可以剪切1nmol pNA底物產(chǎn)生1nmol游離 pNA的酶量。這樣就可以計(jì)算出樣品中含有多少個(gè)酶活力單位的caspase酶活性。
Caspase-6活性(U/mg prot)=x×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×103=2x÷Cpr÷T
V反總:反應(yīng)體系總體積,0.1mL=10-4L;V樣:加入的樣本體積,0.05mL;T:反應(yīng)時(shí)間,h;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;103:?jiǎn)挝粨Q算系數(shù),1μmol =103nmol。
注意事項(xiàng):
1、由于試劑二中含有還原劑(DTT),建議將樣品用水稀釋2倍后,用Bradford法測(cè)定蛋白濃度,以降低DTT對(duì)蛋白濃度測(cè)定的干擾。不建議使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。
2、Caspase活性測(cè)定值低最常見(jiàn)的原因是細(xì)胞未發(fā)生凋亡或細(xì)胞量太少,其次是觀測(cè)時(shí)間不恰當(dāng)。誘導(dǎo)凋亡時(shí),并非劑量越大時(shí)間越長(zhǎng)Caspase活性就越高。建議設(shè)置不同劑量和時(shí)間點(diǎn)如0、2、4、8、16、24小時(shí),以檢測(cè)最佳的觀察點(diǎn)。
3、所測(cè)樣本的值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,可用試劑二稀釋樣本后重新測(cè)定。
4、蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37 oC孵育,肉眼可見(jiàn)顏色變黃時(shí)的OD405值約為0.2,此時(shí)即可測(cè)定。顏色變化不明顯可延長(zhǎng)反應(yīng)或過(guò)夜,但酶活性較強(qiáng)時(shí),孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)將導(dǎo)致反應(yīng)失去線性關(guān)系。
參考文獻(xiàn):
[1] Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J, 1997, 326: 1-16.
[2] Janicke R U, Sprengart M L, Wati M R, et al. Emerging role of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 1999, 6:99-104.
相關(guān)系列產(chǎn)品:
BC3810 Caspase-1活性檢測(cè)試劑盒
BC3820 Caspase-2活性檢測(cè)試劑盒
BC3830 Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒
BC3840 Caspase-4活性檢測(cè)試劑盒
BC3850 Caspase-5活性檢測(cè)試劑盒
BC3880 Caspase-8活性檢測(cè)試劑盒
BC3890 Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒
Caspase-6活性測(cè)定試劑盒 常量法 Caspase-6活性測(cè)定試劑盒 常量法
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