果膠酯酶（PE）活性檢測試劑盒說明書

NaOH滴定法

貨號：BC2700

規(guī)格：50T/48S、100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

50T溶液的配制：

1、 提取液：臨用前加入100mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑4℃避光可保存3個月；

2、 試劑一：臨用前加入100mL蒸餾水，磁力攪拌50℃加熱溶解3小時左右至全溶解，轉移至250mL容量瓶，蒸餾水定容至250mL；用不完的試劑4℃可保存8周；（因試劑一較難配制，建議客戶提前制備）

3、 試劑三工作液：臨用前根據樣本量取出部分試劑三，用蒸餾水稀釋16倍得到試劑三工作液備用，現配現用，用不完的試劑4℃可保存1周；

100T溶液的配制：

1、 提取液：臨用前取1瓶加入100 mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑4℃避光可保存3個月；

2、 試劑一：臨用前加入100mL蒸餾水，磁力攪拌50℃加熱溶解3小時左右至全溶解，轉移至500mL容量瓶，蒸餾水定容至500mL；用不完的試劑4℃可保存8周；（因試劑一較難配制，建議客戶提前制備）

3、 試劑三工作液：臨用前根據樣本量取出部分試劑三，用蒸餾水稀釋16倍得到試劑三工作液備用，現配現用，用不完的試劑4℃可保存1周；

產品說明：

果膠酯酶（Pectinesterase，PE），又稱果膠甲基酯酶、果膠氧化酶，廣泛存在于植物及微生物中。果膠是構成植物細胞壁的主要成分之一，而果膠酯酶催化果膠的甲氧酯水解產生果膠酸和甲醇，在植物果實成熟的細胞壁代謝過程中發(fā)揮著重要作用，在食品工業(yè)中具有極其重要的作用和開發(fā)前景。

果膠酯酶催化果膠水解的過程中釋放H⁺，反應體系pH值降低，通過加入堿液維持反應體系pH始終維持在7.8維持pH所消耗的堿液量可反映果膠酯酶的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果試劑三工作液消耗量過大或過小，建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調式移液器、天平、研缽/勻漿器、10mL離心管或試管、容量瓶、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理

1、將研缽/勻漿器與提取液置于冰上或4℃預冷10min。

2、按照樣本質量（g）：提取液體積（mL）=1:3~5的比例（建議稱取約0.5g樣本，加入1.5mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后，于4℃，12000g離心10min，棄沉淀，取全部上清液置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 將試劑一置于37℃水浴鍋中保溫10min以上。

2、 依次在10mL離心管或試管中加入1mL上清液、25μL試劑二和4mL試劑一，充分混勻，用試劑三工作液調節(jié)pH至7.8（粉紅色）。

3、 將上述離心管或試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋中準確反應60min，每隔20min用試劑三工作液調節(jié)pH，使其維持在7.8（粉紅色），并記錄下所消耗試劑三工作液的體積，記為V（mL）。

三、果膠酯酶活性計算

酶活單位定義：每g組織樣本每分鐘消耗1μmol NaOH的量為一個酶活力單位。

PE活性（U/g 質量）=25×V÷V上清×V提÷W÷T×F=1.25×V×F

V：消耗試劑三工作液的體積，mL；V上清：加入的上清液體積，1mL；V提：加入的提取液體積，1.5mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，60min；F：稀釋倍數。

注意事項：

1、 實驗中酶促反應產生H⁺，此時溶液無色透明，需用試劑三調節(jié)pH到7.8（粉紅色），即溶液會從無色透明突然變?yōu)榉奂t色。

2、 建議正式實驗前進行預實驗，其中測定步驟2中，將樣本上清液、加入試劑二和試劑一混勻后，用試劑三工作液調節(jié)pH至7.8（粉紅色）時，可適當調整每次加入試劑三工作液的體積，防止pH調過。

3、 若樣本酶活性較高，可適當稀釋樣本上清液后再進行測定，計算酶活時乘以稀釋倍數即可。若樣本酶活性較低，建議客戶加大樣本量后重新進行測定，注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1. 稱取0.51g蘋果果肉加入1.5mL提取液進行冰浴勻漿，取1mL上清液于10mL離心管中按照測定步驟操作，最終計得調節(jié)pH所消耗試劑三工作液總體積為0.76mL，按樣本質量計算酶活得：

PE活性（U/g 質量）=25×V÷V上清×V提÷W÷T=0.93 U/g 質量。

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