順烏頭酸酶（ACO）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC4485

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、試劑三：易揮發(fā)試劑，使用后盡快擰緊蓋子，密封后放入-20℃保存；

產(chǎn)品說明：

順烏頭酸酶（Aconitase, ACO）是細(xì)胞內(nèi)一種重要的鐵硫蛋白酶，主要存在于胞漿與線粒體中。ACO催化細(xì)胞內(nèi)檸檬酸經(jīng)中間產(chǎn)物順烏頭酸生成異檸檬酸的可逆反應(yīng)，對維持三羧酸循環(huán)及乙醛酸循環(huán)的順利進(jìn)行起著重要作用。

順烏頭酸酶催化異檸檬酸生成順烏頭酸，順烏頭酸在240nm有特征吸收峰，通過檢測順烏頭酸的產(chǎn)生速率來計算該酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、超聲波細(xì)胞破碎儀、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、順烏頭酸酶的提取（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

A、總順烏頭酸酶的提取

稱取約0.1g組織或收集500萬個細(xì)胞（細(xì)菌），加入1mL試劑一與10μL試劑三，用勻漿器或研缽于冰上勻漿。將勻漿置于冰上超聲波破碎（功率300W，超聲3秒，間隔9秒，重復(fù)15次），4℃，11000×g離心15min，取上清置于冰上待測（若以蛋白濃度計算，則需留出足夠量來測定蛋白濃度Cpr1）。用于測定總順烏頭酸酶活性（建議將樣本用蒸餾水稀釋4 -10倍后檢測）。

B、胞漿與線粒體中順烏頭酸酶的提取

(1) 稱取約0.2 g組織或收集1000萬個細(xì)胞，加入1mL試劑一與10μL試劑三，用勻漿器或研缽于冰上勻漿。

(2) 4℃，600×g離心5min。（若以蛋白濃度計算，則需留出足夠量來測定蛋白濃度Cpr2）。

(3) 將上清液移至另一離心管中，4℃，11000×g離心15min。

(4) 上清液即胞漿提取物，用于測定胞漿中的順烏頭酸酶活性（建議將樣本用蒸餾水稀釋4 -10倍后檢測）。

(5) 在沉淀中加入400μL試劑二與4μL試劑三，置于冰上超聲波破碎（功300W，超聲3秒，間隔9秒，重復(fù)15次），4℃，5000×g離心2min，取上清置于冰上待測。用于測定線粒體中順烏頭酸酶活性（建議將樣本用蒸餾水稀釋4 -10倍后檢測）。

注意：根據(jù)實驗需要選擇性提取細(xì)胞總順烏頭酸酶、胞漿烏頭酸酶或線粒體烏頭酸酶。

二、測定步驟

1. 紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至240nm，分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2. 樣本測定

（1） 將試劑四25℃預(yù)熱15min以上；

（2） 在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入：

三、順烏頭酸酶活性的計算

A、按微量石英比色皿計算：

1、總順烏頭酸酶活性計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

ACO酶活(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷(V樣×Cpr1) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr1×N

（2） 按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

ACO酶活(U/g 質(zhì)量)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷(V樣÷V提取×W）÷T×N=561.11×ΔA÷W×N

（3） 按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

ACO酶活(U/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷（V樣÷V提取×細(xì)胞數(shù)量（萬個））÷T×N

=561.11×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）×N

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；ε：順烏頭酸消光系數(shù)，3.6 L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V提取：樣本總體積，1.01mL；T：反應(yīng)時間，5min；Cpr1：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；10⁶：單位換算系數(shù)，1mmol=1×10⁶nmol；N：稀釋倍數(shù)；W：樣本質(zhì)量，g。

2、胞漿順烏頭酸酶活性計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

ACO酶活(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷(V樣×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N

（2） 按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

ACO酶活(U/g 質(zhì)量)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷(V樣÷V提取×W）÷T×N=561.11×ΔA÷W×N

（3） 按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

ACO酶活(U/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷（V樣÷V提取×細(xì)胞數(shù)量（萬個））÷T×N

=561.11×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）×N

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；ε：順烏頭酸消光系數(shù)，3.6L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02mL；V提取：胞漿樣本總體積，1.01mL；T：反應(yīng)時間，5min；Cpr2：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；10⁶：單位換算系數(shù)，1mmol=1×10⁶nmol；N：稀釋倍數(shù)；W：樣本質(zhì)量，g。

3、線粒體順烏頭酸酶活性計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

ACO酶活(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷(V樣×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

ACO酶活（U/g 質(zhì)量）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁶]÷(V樣÷V樣總×W）÷T×N=244.44×ΔA÷W×N

（3） 按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘凈生產(chǎn)1 nmol 順烏頭酸定義為一個酶活力單位。

ACO酶活（U/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁶]÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬個）÷T×N

=244.44×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）×N

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；ε：順烏頭酸消光系數(shù)，3.6 L/mmol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：線粒體樣本總體積，0.404mL；T：反應(yīng)時間，5min；Cpr2：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；10⁶：單位換算系數(shù)，1mmol=1×10⁶nmol；N：稀釋倍數(shù)；W：樣本質(zhì)量，g。

B、按96孔UV板計算：

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計算即可。

注意事項：

1、 A大于1時，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測定，并在計算時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

2、 當(dāng)ΔA小于0.01時，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間，并在計算時將實際反應(yīng)時間（T）帶入計算公式。

3、 測定蛋白濃度時，由于試劑一本身含有蛋白（約1 mg/mL）所有測定時需要扣除此部分蛋白。

實驗實例：

1. 取0.1g畫眉草樣本，加入1mL試劑一與10μL試劑三進(jìn)行總順烏頭酸酶的提取，取上清稀釋4倍，用微量石英比色皿測得ΔA=A2-A1=0.5693-0.5571=0.0122，按樣本質(zhì)量計算總順烏頭酸酶的酶活得：

ACO酶活(U/g 質(zhì)量)=561.11×ΔA÷W×N=273.8217 U/g 質(zhì)量。

2. 取0.1g兔子腎臟樣本，加入1mL試劑一與10μL試劑三進(jìn)行總順烏頭酸酶的提取，取上清稀釋8倍，用微量石英比色皿測得ΔA=A2-A1=0.4520-0.4186=0.0334，按樣本質(zhì)量計算總順烏頭酸酶的酶活得：

ACO酶活(U/g 質(zhì)量)=561.11×ΔA÷W×N=1499.2859 U/g 質(zhì)量。

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