髓過氧化物酶（MPO）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5715

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取一瓶試劑二加入30mL試劑一，可37℃加熱促進(jìn)溶解，2-8℃可保存2周；

2. 試劑三：低溫下試劑會出現(xiàn)析出凝固現(xiàn)象，臨用前需37℃加熱至澄清透明狀態(tài)；

3. 工作液：臨用前根據(jù)樣本量按照試劑一：試劑四：試劑五=4.8mL：200μL：5μL（5mL，16S）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

髓過氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）是一種由活化的中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞分泌的白細(xì)胞酶，主要存在于中性粒細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞的嗜苯胺藍(lán)顆粒中。當(dāng)白細(xì)胞被激活后，MPO釋放到吞噬泡和血漿，在特定條件下誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和組織損傷，是系統(tǒng)炎癥和氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。

MPO催化H₂O₂分解，同時將鄰聯(lián)茴香胺氧化生成有色物質(zhì)，在460nm處有特征吸收峰，顏色深淺與MPO活性成線性關(guān)系。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織樣本：按質(zhì)量（g）：試劑二體積（mL）=1：5~10比例加入試劑二（建議稱取0.1g樣本，加入1.0mL試劑二），冰浴勻漿后，于4℃，12000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

2. 細(xì)胞樣本：按細(xì)胞數(shù)量（10⁶）：試劑二體積（mL）=5~10：1的比例加入試劑二（建議5×10⁶個細(xì)胞加入1.0mL試劑二），冰浴超聲破碎細(xì)胞（功率200W，超聲3s，間隔7s，總時間3min），然后于4℃，12000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

3. 液體樣本：按液體體積（mL）：試劑二體積（mL）=1：1的比例加入試劑二（相當(dāng)于稀釋2倍），混勻，于4℃，12000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。（若測定數(shù)值較小，可以調(diào)整比例進(jìn)行前處理，例如2：1或3:1）

二、 測定步驟

1．可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至460nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2．在1.5mL EP管按下表順序加樣：

三、MPO活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白在37℃反應(yīng)體系中每小時催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個酶活單位。

MPO活性（U/mg prot）=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(Cpr×V樣) ÷T= 3.053×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：每g組織在37℃反應(yīng)體系中每小時催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個酶活單位。

MPO活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(W÷V提取×V樣) ÷T = 3.053×ΔA÷W

3. 按細(xì)胞數(shù)目計算

單位的定義：每10⁶個細(xì)胞在37℃反應(yīng)體系中每小時催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個酶活單位。

MPO活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(N÷V提取×V樣) ÷T = 3.053×ΔA÷N

4. 按液體體積計算

單位的定義：每mL液體在37℃反應(yīng)體系中每小時催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個酶活單位。

MPO活性（U/mL）=ΔA÷(ε×d)×V反總÷V樣×F÷T=6.106×ΔA

ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺消光系數(shù)，11.3mL/μmol/cm；d：光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.345mL；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V提取：組織/細(xì)胞樣本處理時加入試劑二的體積，1mL；F：液體前處理稀釋倍數(shù)，2；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞數(shù)目，以10⁶計；T：酶促反應(yīng)時間，30min=0.5h。

注意事項：

1. 建議每次實驗前查看試劑二和試劑三是否澄清透明，若不澄清透明，需37℃加熱至溶液澄清透明方可使用。

2. 如果?A小于0.01或測定管吸光值接近對照管，可以增加樣本量或者延長37℃酶促反應(yīng)時間后再進(jìn)行測定；如果?A測定大于0.5或A測定大于1.5，建議將樣本勻漿后的上清液用試劑二適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定。注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1. 取0.1029g小鼠肺臟樣本，加入1mL試劑二進(jìn)行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA=A測定-A對照=0.401-0.088=0.313，按樣本質(zhì)量計算得：

MPO活性（U/g 質(zhì)量）=3.053×ΔA÷W = 9.287 U/g 質(zhì)量。

2. 取4×10⁶個細(xì)胞KB，加入1mL試劑二進(jìn)行冰浴超聲破碎，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA=A測定-A對照=0.094-0.046=0.048，按樣本細(xì)胞數(shù)目計算得：

MPO活性（U/10⁶ cell）=3.053×ΔA÷N = 0.037 U/10⁶ cell。

3. 取0.5mL馬血清樣本，加入0.5mL試劑二，混勻，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA=A測定-A對照=0.142-0.049=0.093，按液體體積計算得：

MPO活性（U/mL）=6.106×ΔA = 0.568 U/mL。

參考文獻(xiàn)：

[1] Bradley PP, Priebat DA, Christensen RD. et al. Measurement of cutaneous inflammation: estimation of neutrophil content with an enzyme marker [J]. The Journal of Investigative Dermatology, 1982, 78(3): 206-209.

[2] Krawisz J E, Sharon P, Stenson W F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity [J]. Gastroenterology, 1984, 87(6): 1344-1350.

[3] Tatjana Momi?, Zoran Vuj?i?, Vesna Vasi?. Kinetics of inhibition of peroxidase activity of myeloperoxidase by quercetin [J]. International Journal of Chemical Kinetics, 2008, 40(7): 384-394.

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