組織銅（Cu）含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5565

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：若有試劑析出，置于37℃水浴溶解即可。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：10mmol/L（即10000µmol/L）硫酸銅標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

銅（Cu）是人體必需的微量元素之一，也是蛋白質(zhì)以及酶的重要組成部分。可以存在于紅細(xì)胞的內(nèi)外，主要功能是輔助造血，即催化血紅蛋白的合成。銅元素可以適當(dāng)促進(jìn)人體的骨骼發(fā)育，促進(jìn)人體神經(jīng)系統(tǒng)以及腦部發(fā)育，維持嬰幼兒的正常生長(zhǎng)發(fā)育，因此，測(cè)定組織內(nèi)銅離子含量可知體內(nèi)是否缺銅。

在酸性條件下，Cu²⁺從銅藍(lán)蛋白和清蛋白中解離出來(lái)，與絡(luò)合劑3,5-二溴-PAESA反應(yīng)，產(chǎn)生紫色絡(luò)合物，在580nm處有特征吸收峰，在一定范圍內(nèi)吸光度與濃度成正比，從而計(jì)算出Cu²⁺濃度。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min，取上清待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至580nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、 80µmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：取100µL 10mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液加入400μL 蒸餾水混勻，即2000µmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品；再取40μL 2000µmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品和960μL 蒸餾水混合，即配成80µmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3、 實(shí)驗(yàn)前根據(jù)樣本量取部分試劑一37℃預(yù)熱10min。

4、 操作表：（在1.5mLEP管或96孔板中加入下列試劑）

三、組織銅含量的計(jì)算

1. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

組織銅含量（μmol/g）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V提取÷W =0.08×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

2. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

組織銅含量（μmol/g prot）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V提取÷（Cpr×V提取）=80×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，80µmol/L；V提取：前處理中蒸餾水體積，0.001L；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL。

注意事項(xiàng)：

1. 37℃孵育5min后請(qǐng)立即測(cè)定吸光度，若樣本數(shù)量過(guò)多，可分批次測(cè)定，盡量確保在20min內(nèi)完成測(cè)定。

2. 如果樣本測(cè)定吸光值大于0.5，建議將樣本用蒸餾水稀釋后進(jìn)行測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式。

3. 如果樣本測(cè)定吸光值小于0.005或接近空白管吸光值，可適當(dāng)增大樣本量，空白管和標(biāo)準(zhǔn)管也需要進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 稱取0.1g鼠肺加入1mL蒸餾水進(jìn)行勻漿研磨，離心取上清后按照測(cè)定步驟操作，使用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.118-0.089=0.029，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.283-0.089=0.194，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

組織銅含量（μmol/g）=0.08×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W =0.120μmol/g。

2. 稱取0.1010g杏仁加入1mL蒸餾水進(jìn)行勻漿研磨，離心取上清后按照測(cè)定步驟操作，使用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.174-0.089=0.085，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.283-0.089=0.194，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

組織銅含量（μmol/g）=0.08×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W =0.347μmol/g。

3. 稱取0.1053g黃豆粉加入1mL蒸餾水進(jìn)行勻漿研磨，離心取上清后按照測(cè)定步驟操作，使用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.242-0.089=0.153，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.283-0.089=0.194，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

組織銅含量（μmol/g）=0.08×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W =0.599μmol/g。

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