α-酮戊二酸（α-KG）含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5425

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑三：臨用前加入1.3mL蒸餾水充分溶解。未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑四：臨用前加入0.5mL蒸餾水充分溶解。未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入0.856mL蒸餾水充分溶解，配制成80μmol/mL α-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，2-8℃可保存4周。

4、 試劑四工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑四：蒸餾水=0.1mL：0.4mL（共0.5mL，50T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5、 400nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：實(shí)驗(yàn)前取50μL的80μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入950μL蒸餾水充分混合配制成4μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。再取100μL 4μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和900μL蒸餾水混合配制成0.4 μmol/mL（400nmol/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

α-酮戊二酸（α-Ketoglutarate，α-KG）是三羧酸循環(huán)中重要的代謝中間產(chǎn)物，是連接細(xì)胞內(nèi)碳-氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。α-酮戊二酸作為一種短鏈羧酸分子，是谷氨*、谷*酸等多種重要的氨基酸的前體，不僅直接參與供能，還參與細(xì)胞內(nèi)多種化學(xué)反應(yīng)，具有多種生理作用。

GDH催化NH₄⁺、α-酮戊二酸和NADH，生成谷*酸和NAD⁺，引起340nm吸光度下降。通過(guò)測(cè)定NADH的變化，計(jì)算α-酮戊二酸含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/金屬浴/恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、蒸餾水和冰。

操作步驟：

樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液一體積（mL）為5~1：1的比例（建議5百萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，12000g離心10min后取上清待測(cè)。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。

二、測(cè)定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，紫外分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

3、在微量石英比色皿/96孔UV板中按下表步驟加樣：

三、α-酮戊二酸（α-KG）含量計(jì)算

按樣本蛋白濃度計(jì)算

α-KG含量(nmol/mg prot) = C_{標(biāo)準(zhǔn)}× (ΔA_測(cè)定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_空白)×V_樣÷ (Cpr×V_樣)×F

= 400×(ΔA_測(cè)定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_空白)÷Cpr×F

按樣本質(zhì)量計(jì)算

α-KG含量(nmol/g 質(zhì)量)= C_{標(biāo)準(zhǔn)}×(ΔA_測(cè)定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_空白) × (V_上清+V_提取液二)÷ (W×V_上清÷V_提取液一)×F

= 475×(ΔA_測(cè)定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_空白)÷W×F

按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)目計(jì)算

α-KG含量(nmol/10⁶ cell) = C_{標(biāo)準(zhǔn)}×(ΔA_測(cè)定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_空白)×(V_上清+V_提取液二)÷(N×V_上清÷V_提取液一)×F

= 475×(ΔA_測(cè)定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_空白)÷N×F

按液體體積計(jì)算

α-KG含量(nmol/mL) = C_{標(biāo)準(zhǔn)}×(ΔA_測(cè)定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_空白)×(V_上清+V_提取液二)÷[V_液體×V_上清÷(V_液體+V_提取液一)]×F

= 5225×(ΔA_測(cè)定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_空白)×F

C_{標(biāo)準(zhǔn)}：α-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，400 nmol/mL；V_樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.06mL；V_上清：提取時(shí)上清的體積，0.8mL；V_提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V_提取液一：加入提取液一的體積，1mL；V_液體：液體樣本體積，0.1mL；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)目，以10⁶計(jì)；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. 采用96孔UV板測(cè)定時(shí)，如果樣本A1_測(cè)定＜A1_空白或?A_測(cè)定大于0.5，可以用蒸餾水對(duì)樣本進(jìn)行稀釋或者縮短第二步37℃反應(yīng)時(shí)間；如果?_測(cè)定小于0.01，可以加大樣本量或者延長(zhǎng)第二步37℃反應(yīng)時(shí)間。最終計(jì)算時(shí)同步修改計(jì)算公式。

2. 采用微量石英比色皿測(cè)定時(shí)，如果樣本A1_測(cè)定＜A1_空白或?A_測(cè)定大于0.8，可以用蒸餾水對(duì)樣本進(jìn)行稀釋或者縮短第二步37℃反應(yīng)時(shí)間；如果?A_測(cè)定過(guò)小，可以加大樣本量或者延長(zhǎng)第二步37℃反應(yīng)時(shí)間。最終計(jì)算時(shí)同步修改計(jì)算公式。

3. 提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測(cè)定。如需測(cè)定蛋白含量，需另取組織。

4. 溫度對(duì)該實(shí)驗(yàn)影響較大，務(wù)必保持反應(yīng)溫度在37℃。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取0.1066g小鼠肝臟組織，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，用96孔UV板測(cè)得計(jì)算ΔA_測(cè)定=A1_測(cè)定-A2_測(cè)定=0.694-0.679=0.017，ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}=A1_{標(biāo)準(zhǔn)}-A2_{標(biāo)準(zhǔn)}=0.594-0.307=0.287，ΔA_空白=A1_空白-A2_空白=0.637-0.633=0.004。帶入公式計(jì)算：

α-KG含量（nmol/g 質(zhì)量）=475×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =204.69 nmol/g 質(zhì)量

參考文獻(xiàn)：

[1] Azmi N E, Ahmad M, Abdullah J, et al. Biosensor based on glutamate dehydrogenase immobilized in chitosan for the determination of ammonium in water samples[J]. Analytical Biochemistry, 2009, 388(1):28-32.

[2] Fei Ding,Qiannan Hu,Meiling Wang,et al. Knockout of SlSBPASE Suppresses Carbon Assimilation and Alters Nitrogen Metabolism in Tomato Plants. International Journal of Molecular Sciences. December 2018;(IF4.183)

[3] Lin Y, Nan J, Shen J, et al. Canagliflozin impairs blood reperfusion of ischaemic lower limb partially by inhibiting the retention and paracrine function of bone marrow derived mesenchymal stem cells[J]. EBioMedicine, 2020, 52: 102637  

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