D-乳酸（D-LA）含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC5355

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入160μL蒸餾水溶解。2-8℃可以保存4周（該試劑為凍干試劑，可能存在肉眼觀察試劑量很少的現(xiàn)象，此現(xiàn)象不影響使用）；

2、 試劑二工作液的配制：臨用前按試劑二（V）：蒸餾水（V）=10μL：90μL（5T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少；

3、 試劑三：臨用前加入5mL 蒸餾水混勻，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融，-20℃保存4周；

4、 標(biāo)準(zhǔn)品：1000μmol/mL D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)液。臨用前取20μL 1000μmol/mL D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)液和1980μL蒸餾水混合配成10μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液；再吸取20μL 10μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液和620μL蒸餾水混合配成0.3125μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

產(chǎn)品說明：

乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān)，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。D-乳酸在D-乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時使NAD⁺還原生成NADH和H⁺，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性formazan，其在450nm處有最大吸收峰，據(jù)此可計算D-乳酸含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：                                                                                                 

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、分析天平、研缽/勻漿器/超聲波細(xì)胞破碎儀、離心機(jī)、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、蒸餾水和冰。 

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

3. 血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，12000g離心10min后取上清待測。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。

二、測定步驟

1、分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，波長調(diào)至450nm，分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表：（按順序?qū)⑾铝性噭┘釉?/span>96孔板/EP管中）

三、D-乳酸含量的計算

（1）按照樣本蛋白濃度計算

D-LA含量（μmol/mg prot）= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣本÷（V樣本×Cpr）
= 0.3125×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

D-LA含量（μmol/g 質(zhì)量）

= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）

= 0.3711×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計算

D-LA含量（μmol/10⁶ cell）
= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）

= 0.3711×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N

（4）按照液體體積計算

D-LA含量（μmol/mL）

= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]
= 4.082×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.3125μmol/mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；N：細(xì)胞數(shù)量，以10⁶計；V液體：液體樣本體積，0.1mL。

注意事項：

1. 提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取組織。

2. ΔA測定的測定范圍在0.01-1之間。如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測定，如果測定吸光值小于線性范圍吸光值，需要增加樣本量后再次測定，注意同步計算公式。

實驗實例：

1、 取0.104g兔肌肉加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.321-0.179=0.142，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.405-0.122=0.283，按樣本質(zhì)量計算含量得：

D-LA含量（μmol/g 質(zhì)量）=  0.3711×ΔA 測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W =1.7904 μmol/g質(zhì)量。

2、 取100μL牛血清加入1mL提取液一，離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.221-0.169=0.052，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.405-0.122=0.283，按照液體體積計算含量得：

D-LA含量（μmol/mL）= 4.082×ΔA 測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)=0.75 μmol/mL。

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