抗氟離子酸性磷酸酶（FRAP）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5455

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑三：臨用前加入1mL蒸餾水，充分溶解，未用完的試劑-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融。一支試劑溶解后可以做100T，為了延長試劑盒使用時間，因此多給一支粉劑。

2、 試劑四：臨用前加入5.5mL蒸餾水，充分溶解，未用完的試劑2-8℃保存可以保存4周。

3、 試劑五：臨用前根據(jù)樣本量按照試劑五：蒸餾水=1:9的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

4、 標(biāo)準(zhǔn)品：5μmol/mL 酚標(biāo)準(zhǔn)液。臨用前取100μL的5μmol/mL 酚標(biāo)準(zhǔn)液于EP管中，加入300μL蒸餾水充分溶解，配制成1.25 μmol/mL的酚標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說明：

抗氟離子酸性磷酸酶(fluoride resistant acid phosphatase, FRAP)是酸性磷酸酶的一種?？狗x子酸性磷酸酶主要分布于在絕大多數(shù)細(xì)胞的溶酶體中、前列腺(prostate gland)、腦、肝臟、脾臟和血小板。

抗氟離子酸性磷酸酶的活性不被氟離子抑制，而其他的酸性磷酸酶的活性則會受到氟離子的抑制。酸性條件下，抗氟離子酸性磷酸酶催化PN PP生成對硝 基苯*。對硝 基苯*在堿性條件下呈黃色，可以在400nm波長下檢測吸光度。產(chǎn)物黃色越深，說明抗氟離子酸性磷酸酶活性越高，反之則酶活性越低。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/超聲破碎儀、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、液體：直接測定。(若溶液呈現(xiàn)渾濁，則離心取上清后再測定)。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm，可見分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2、操作表：

混勻后，測定在400nm處的吸光度，記作A_測定，A_對照，A_{標(biāo)準(zhǔn)}，A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}。?A_測定=A_測定-A_對照，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}。（標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)準(zhǔn)空白管只需做1-2次。）

三、FRAP活性計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酚定義為一個酶活力單位。

FRAP活性（U/mg prot）=(?A_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣÷（Cpr×V_樣）÷T×10³×F=41.67×?A_測定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷Cpr×F

(2) 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酚定義為一個酶活力單位。

FRAP活性（U/g 質(zhì)量）= (?A_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣÷（W÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=41.67×?A_測定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)目計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酚定義為一個酶活力單位。

FRAP活性（U/10⁴ cell）= (?A_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣÷（N÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=41.67×?A_測定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×F

(4) 按血清（漿）等液體體積計算

單位的定義：每mL血清（漿）等液體每分鐘催化產(chǎn)生1nmol酚定義為一個酶活力單位。

FRAP活性（U/mL）= (?A_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣÷V_樣÷T×10³×F=41.67×?A_測定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×F

C_{標(biāo)準(zhǔn)}：酚標(biāo)準(zhǔn)液，1.25 μmol/mL ；V_樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.01mL；V_樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，30min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；10³：單位換算系數(shù)，1μmol/mL=10³nmol/mL；N：細(xì)胞數(shù)量，以萬計；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1、 如果測定的吸光值或?A_測定大于1.5，可以對樣本進(jìn)行稀釋或者縮短37℃酶促反應(yīng)時間；測定的吸光值或?A_測定小于0.01，可以加大樣本量或者延長37℃酶促反應(yīng)時間。最終計算時同步修改計算公式。

實驗實例：

1、 稱取0.1074g兔子肝臟組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，將上清液稀釋2倍后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?A_測定=A_測定-A_對照=0.485-0.067=0.418，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.720-0.070=0.650，帶入公式計算：

FRAP活性（U/g 質(zhì)量）=41.67×?A_測定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =499.013 U/g 質(zhì)量

2、 稱取0.1057g竹子葉，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?A_測定=A_測定-A_對照=0.396-0.110=0.286，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.720-0.070=0.650，帶入公式計算：

FRAP活性（U/g 質(zhì)量）= 41.67×?A_測定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =173.461U/g 質(zhì)量

3、 吸取0.01mL羊血清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?A_測定=A_測定-A_對照=0.126-0.070=0.056，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.720-0.070=0.650，帶入公式計算： 

FRAP活性（U/mL）=41.67×?A_測定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×F =3.590 U/mL 

參考文獻(xiàn)：

[1] Megat R, Wahab A, Dasor M M, et al. Crevicular tartrate resistant acid phosphatase activity and rate of tooth movement under different continuous force applications[J]. African journ al of pharmacy and pharmacology, 2011, 5(20):2213-2219. 

[2] Natasˇa Mitic′, Mohsen Valizadeh, Eleanor W.W. Leung, et al. Human tartrate-resistant acid phosphatase becomes

an effective ATPase upon proteolytic activation [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics 439 (2005) 154–164.

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