植酸酶活性檢測(cè)試劑盒

微量法

貨號(hào)：BC3145

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前加入到緩沖液中（可吸取緩沖液到試劑一瓶中反復(fù)沖洗），充分震蕩溶解，用不完的試劑2-8℃可保存4周。

2. 試劑二：臨用前加入3.15mL蒸餾水充分溶解，再將槍頭伸入液面下緩慢加入0.85mL濃硫酸，2-8℃可保存4周。

3. 試劑三：臨用前加入20mL蒸餾水充分溶解，2-8℃可保存4周。。

4. 工作液：臨用前根據(jù)測(cè)定數(shù)量將試劑二：試劑三=1mL：5mL (約40T)的比例混勻，配制后于2-8℃可保存3天。

5. 標(biāo)準(zhǔn)品：5μmol/mL無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

植酸酶（Phytase）又叫肌醇六磷酸酶，是一種蛋白質(zhì)和糖的結(jié)合酶，植酸酶可以分解植酸產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷和肌醇，極大的提高生物對(duì)養(yǎng)分的利用率，天然植酸酶廣泛存在于植物、動(dòng)物組織和微生物中，現(xiàn)多用微生物來(lái)合成植酸酶進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用，植酸酶在糧食生產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域具有廣泛的研究?jī)r(jià)值。

在一定的環(huán)境條件下，植酸酶可以分解植酸鈉（肌醇六磷酸十二鈉）產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷和肌醇衍生物，在酸性條件下，無(wú)機(jī)磷和鉬酸銨顯色劑發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的鉬藍(lán)物質(zhì)，其在700nm有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的含量，可計(jì)算出植酸酶的活性。 

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、濃硫酸、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照樣本質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1:5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿；4000g 4℃離心10min（若仍然渾濁，可延長(zhǎng)離心時(shí)間），取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌或細(xì)胞樣本：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000:1 的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液）加入提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲 3s，間隔 7s，總時(shí)間3min），4000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

3. 培養(yǎng)液或其他液體：直接檢測(cè)。若溶液渾濁則離心后取上清進(jìn)行測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至700nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：將5μmol/mL無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋至5、3、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μmol/mL備用。

3、標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋可參考下表：

備注：實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需50µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4、在EP管中按下表步驟加樣：

     常溫靜置10min，8000g，室溫離心10min，吸取200μL上清，于700nm處測(cè)定吸光值，分別記為A_測(cè)定、A_對(duì)照、A_{標(biāo)準(zhǔn)}、A_空白。分別計(jì)算 ΔA=A_測(cè)定-A_對(duì)照，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_空白（標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白管只需做 1-2 次，每個(gè)測(cè)定管需設(shè)置一個(gè)對(duì)照管）。

二、植酸酶活性的計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA（y，ΔA）代入公式計(jì)算樣本濃度（x，μmol/mL）。

2. 植酸酶活性計(jì)算

（1）按樣本蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

單位定義：在37℃，pH5.5環(huán)境下，每mg組織蛋白每分鐘在反應(yīng)體系釋放1μmol無(wú)機(jī)磷為1個(gè)酶活力單位。

植酸酶活性（U/mg prot）= x×V樣總÷（Cpr×V樣總）÷T= x÷Cpr÷30；

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：在37℃，pH5.5環(huán)境下，每g組織每分鐘在反應(yīng)體系釋放1μmol無(wú)機(jī)磷為1個(gè)酶活力單位。

植酸酶活性（U/g 質(zhì)量）= x×V樣總÷W÷T=x÷W÷30；

（3）按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

單位定義：在37℃，pH5.5環(huán)境下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘在反應(yīng)體系釋放1μmol無(wú)機(jī)磷為1個(gè)酶活力單位。

植酸酶活性（U/10⁴cell）=  x×V樣總÷N÷T= x÷N÷30；

（4）按照液體樣本體積計(jì)算

單位定義：在37℃，pH5.5環(huán)境下，每mL樣本每分鐘在反應(yīng)體系釋放1μmol無(wú)機(jī)磷為1個(gè)酶活力單位。

植酸酶活性（U/mL）= x×V樣÷V樣÷T= x÷30；

V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；N：細(xì)胞數(shù)量，以萬(wàn)計(jì)。

注意事項(xiàng)：

1. 為防止沸水浴10min過(guò)程中水分散失，建議使用螺旋管或用封口膜給EP管纏口。

2. 如果測(cè)定吸光值過(guò)低或接近空白，適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或加大樣本量后，重新測(cè)定。如果A_測(cè)定大于1.5或者ΔA超過(guò)檢測(cè)范圍，建議將樣本用蒸餾水進(jìn)行適當(dāng)稀釋后進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

3. 結(jié)果于40min內(nèi)測(cè)定完畢。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

取0.15g菠菜種子（已發(fā)芽），按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算A_測(cè)定 = 0.692，A_對(duì)照 = 0.573，?A= 0.119，將?A代入標(biāo)曲公式y = 0.2991x + 0.0121，得出x= 0.357，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

植酸酶活性（U/g 質(zhì)量）= 0.0794 U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Senna R , Simonin V , Silva-Neto M A C , et al. Induction of acid phosphatase activity during germination of maize (Zea mays) seeds.[J]. Plant Physiology & Biochemistry, 2006, 44(7-9):467-473.

[2] Iqbal T H , Lewis K O , Cooper B T . Phytase activity in the human and rat small intestine[J]. Gut, 1994, 35(9):1233-1236.

[3] Azeke M A ,  Egielewa S J ,  Ihimire E . Effect of germination on the phytase activity, phytate and total phosphorus contents of rice (Oryza sativa), maize (Zea mays), millet (Panicum miliaceum), sorghum (Sorghum bicolor) and wheat (Triticum aestivum)[J]. Journal of Food Science&Technology, 2011.

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