肌酸含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。

貨號(hào)：BC4925

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前加入0.33mL乙醇溶解，-20℃可以保存2周，試劑若變?yōu)樯钭厣珓t不可再使用；

2. 試劑一工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑一：試劑一稀釋液=40μL：560μL（共600μL，約15T）的比例進(jìn)行配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，當(dāng)天用完；

3. 標(biāo)準(zhǔn)品：1 mg一水肌酸。臨用前加入1 mL蒸餾水，充分溶解，即1 mg/mL一水肌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用不完的試劑4℃保存一個(gè)月。

產(chǎn)品說(shuō)明：

肌酸(Creatine)是一種含氮化合物，自然存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)，能夠輔助為肌肉和神經(jīng)細(xì)胞提供能量。肌酸可由精*酸（arginine)、甘*酸（glycine）及甲硫*酸（methionine）三種氨基酸合成，可由人體自行合成，也可以從食物中攝取。大約95%的肌酸存在于骨骼肌中，主要存在形式為磷酸肌酸。肌酸作為一種補(bǔ)充劑主要通過(guò)增加肌肉質(zhì)量，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)能力。肌酸也被作為神經(jīng)肌肉疾病的一種治療藥被廣泛研究，它可能有助于保護(hù)神經(jīng)和改善細(xì)胞生物功能狀態(tài)。

肌酸可在堿性條件下與聯(lián)乙酰-α-萘酚發(fā)生反應(yīng)，生成紅色產(chǎn)物在530 nm處有吸收峰。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液一體積（mL）為5~10：1的比例（建議5×10⁶個(gè)細(xì)胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

3. 血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，12000g離心10min后取上清待測(cè)。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至530 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：將1 mg/mL一水肌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用蒸餾水稀釋至200、160、130、100、50、25、12.5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。

3、 按下表步驟加樣：

注：空白管只需做1-2次。

三、肌酸含量計(jì)算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以肌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL），以ΔA標(biāo)準(zhǔn)為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=kx+b，將ΔA測(cè)定帶入方程求得x（μg/mL）。

2、 計(jì)算公式

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

肌酸含量（μg/mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）×0.879=x÷Cpr×0.879

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

肌酸含量（μg/g 質(zhì)量）=x×（V上清+V提取液二）÷ （W×V上清÷V提取液一）×0.879=1.044×x÷W

（3）按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

肌酸含量（μg/10⁴ cell）= x×（V上清+V提取液二）÷（細(xì)胞數(shù)量×V上清÷V提取液一）×0.879

= 1.044×x÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照血清（漿）體積計(jì)算

肌酸含量（μg/mL）=x×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]×0.879=11.482×x

V樣：加入樣本體積，20 μL=0.02 mL；V上清：提取液一提取時(shí)上清液體積，0.8 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量，以10⁴計(jì)；V提取液一：加入提取液一體積，1 mL；V提取液二：

加入提取液二體積，0.15 mL；V液體：液體樣本體積，0.1 mL；0.879：換算系數(shù)，一水肌酸相對(duì)分子質(zhì)量149.15，無(wú)水肌酸相對(duì)分子質(zhì)量131.13，0.879=131.13÷149.15。

注意事項(xiàng)：

1、顯色完成后，請(qǐng)?jiān)?/span>10 min之內(nèi)完成檢測(cè)。

2、提取液中含有蛋白沉淀劑，提取的上清液不能用于蛋白濃度的測(cè)定。若想要用蛋白濃度計(jì)算肌酸含量需要另取樣本，即取相同質(zhì)量的組織、同等數(shù)目的細(xì)菌或細(xì)胞，用1.1875mLPBS（生理鹽水）勻漿；取相同體積的血清（漿），用1.206mLPBS（生理鹽水）勻漿（相當(dāng)于提取步驟最終樣本上清液），用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

3、如果測(cè)定吸光值低于或超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液線性范圍的吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測(cè)定。

4、試劑一、試劑二對(duì)人體有刺激性，請(qǐng)采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施。為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴乳膠手套操作。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

取0.1g兔腎臟加入1mL提取液一進(jìn)行勻漿研磨離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)定后計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.128-0.064=0.064，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0062x-0.0143，計(jì)算x=12.629。按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

肌酸含量（μg/g 質(zhì)量）=1.044×x÷W =131.85 μg/g 質(zhì)量。

取100μL牛血清加入1mL提取液一，離心取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)定后計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.271-0.07=0.201，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0062x-0.0143，計(jì)算x=34.726。按照液體體積計(jì)算含量得：

肌酸含量（μg/mL）=11.482×x= 398.7 μg/mL。

肌酸含量檢測(cè)試劑盒