海藻糖合成酶（TS）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC4955

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一瓶先加入6mL蒸餾水，震蕩使其充分溶解（若溶解后的試劑中有黑色顆粒物，可離心后取上清使用），用不完的試劑2-8℃保存2周。

2、 工作液的配制：臨用前將試劑三和試劑四1:1等體積混合，根據(jù)樣本實際所需用量現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、 標準品：臨用前加入1 mL蒸餾水配制成50 μmol/mL的麥芽糖標準溶液，用不完的試劑2-8℃保存2周。然后用蒸餾水八倍稀釋成6.25 μmol/mL的麥芽糖標準溶液（建議吸取25 μL 50μmol/mL麥芽糖標準溶液，加入175 μL蒸餾水中，充分混勻）待測，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

海藻糖是功能性低聚糖，具有非還原性、保濕性、熱酸穩(wěn)定性、抗凍結性等特性，是細胞在不良環(huán)境條件下產(chǎn)生的一種重要的抗逆應激物之一，它對生物大分子和生物組織有著非特異性的保護作用。

海藻糖合成酶（Trehalose Synthase，TS）能催化麥芽糖生成海藻糖，是海藻糖生物合成的關鍵途徑之一。本試劑盒使用糖化酶分解剩余麥芽糖為葡萄糖，通過葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖含量，按照麥芽糖減少的量表示海藻糖合成酶的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、低溫離心機、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、

蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬細菌或細胞加入1 mL提取液，超聲波破碎細胞（功率200W，超聲3s，間隔9s，重復30次）；然后8000 g，4℃，離心10 min，取上清（若上清不夠澄清，建議重復上述離心步驟），置于冰上待檢。

組織：按照組織質(zhì)量（g）: 提取液體積（mL）為1 : 5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液），進行冰浴勻漿。8000 g，4℃，離心10 min，取上清（若上清不夠澄清，建議重復上述離心步驟，置于冰上待檢。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至505 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 操作表：

（1）酶促反應（在EP管中進行以下操作）：

（2）顯色反應（在EP管或96孔板中進行以下操作）

注：空白管和標準管只需測1~2次。

三、酶活性計算

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1 nmol 麥芽糖生成1 nmol 海藻糖定義為一個酶活力單位。

TS酶活（U/mg prot）= C標×ΔA測定÷ΔA標準×V樣÷（V樣×Cpr）÷T×F×1000÷2

=26.041×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr×F

2、按樣本質(zhì)量計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化1 nmol 麥芽糖生成1 nmol 海藻糖定義為一個酶活力單位。

TS酶活（U/g 質(zhì)量）= C標×ΔA測定÷ΔA標準×V樣÷（V樣÷V樣總×W）÷T×F×1000÷2

=26.041×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F

3、按細菌或細胞數(shù)量計算：

單位的定義：每10⁴個細菌或細胞每分鐘催化1 nmol 麥芽糖生成1 nmol 海藻糖定義為一個酶活力單位。

TS酶活（U/10⁴ cell）= C標×ΔA測定÷ΔA標準×V樣÷（V樣÷V樣總×cell）÷T×F×1000÷2

=26.041×ΔA測定÷ΔA標準÷cell×F

C標：標準管濃度，6.25 μmol/mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；T：反應時間，120 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；cell：細胞或細菌總數(shù)，以萬計；F：稀釋倍數(shù)；1000：單位換算系數(shù)，1 μmol=1000 nmol；2：1分子麥芽糖可轉(zhuǎn)化為2分子葡萄糖。

注意事項：

1、 當吸光值大于1.5或者ΔA測定大于1時，建議將樣本稀釋后測量。計算公式注意乘以稀釋倍數(shù)。

實驗實例：

1、 取0.1 g小鼠肝臟加入1 mL提取液進行勻漿研磨，取上清用蒸餾水稀釋2倍后按照測定步驟操作，用96孔板測定后計算ΔA測定=A對照-A測定=1.177-0.536=0.641、ΔA標準=A標準-A空白=1.031-0.049=0.982，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

TS酶活（U/g 質(zhì)量）= 26.041×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F=339.965 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1 g海帶加入1 mL提取液進行勻漿研磨，取上清按照測定步驟操作，用96孔板測定后計算ΔA測定=A對照-A測定=1.366-0.793=0.573、ΔA標準=A標準-A空白=1.031-0.049=0.982，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

TS酶活（U/g質(zhì)量）= 26.041×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F=151.950 U/g 質(zhì)量。

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