目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC1545-100T/48S亞硝酸還原酶(NiR)檢測試劑盒 微量法
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T/24S |
| 貨號 | BC1540 | 應用領域 | 環(huán)保,化工,生物產業(yè),農業(yè),綜合 |
| 主要用途 | 亞硝酸還原酶(NiR)活性檢測 |
亞硝酸還原酶（NiR）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC1545
規(guī)格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體3mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體10mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 液體10mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：每瓶臨用前加入2.5mL蒸餾水充分溶解，2-8℃保存2周；
2、 試劑三：臨用前加入5mL蒸餾水，可70-80℃加熱溶解；2-8℃可以保存3個月；
3、 試劑五：若出現(xiàn)沉淀，可70-80℃加熱溶解；
4、 標準品：10µmol/mL亞硝*標準溶液；
5、 工作液：臨用前根據(jù)樣本量將試劑四和試劑五按1:1的比例混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。
產品說明：
亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）是亞硝態(tài)氮還原過程中的關鍵酶，在自然界氮素循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用，其廣泛存在于微生物及植物體內，能夠催化亞硝酸鹽還原，減少亞硝態(tài)氮在環(huán)境中的積累，降低其對生物體生長發(fā)育的毒害作用。
亞硝酸還原酶可將NO2-還原為NO，使樣本中參與重氮化反應生成紫紅色化合物的NO2-減少，即540nm處吸光值的變化可反應樣本中亞硝酸還原酶的活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：按樣本質量（g）: 提取液體積（mL）1 : 5~10比例（建議稱取0.1g樣本，加入1.0mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后，于4 ℃，10000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。
2. 細菌或細胞：按細胞數(shù)量（104）：提取液體積（mL）500~1000 : 1的比例（建議500萬細胞加入1.0mL提取液）加入提取液，冰浴超聲破碎細胞（功率200w，超聲3s，間隔7s，總時間3min），然后于4℃，10000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。
二、測定步驟
1、 分光光度計/酶標儀預熱30min 以上，調節(jié)波長至540nm，分光光度計蒸餾水調零。
2、 標準液的稀釋：將10µmol/mL的標準溶液用蒸餾水稀釋至0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125 µmol/mL標準溶液待測。
3、 標準液稀釋可參考下表：
序號 | 稀釋前濃度（µmol/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（µmol/mL） |
1 | 10 | 20 | 180 | 1 |
2 | 1 | 100 | 400 | 0.2 |
3 | 0.2 | 200 | 200 | 0.1 |
4 | 0.1 | 200 | 200 | 0.05 |
5 | 0.05 | 200 | 200 | 0.025 |
6 | 0.025 | 200 | 200 | 0.0125 |
7 | 0.0125 | 200 | 200 | 0.00625 |
8 | 0.00625 | 200 | 200 | 0.003125 |
備注：下述實驗中每個標準管需70µL標準液（注意不要在此步驟直接檢測吸光值）。
4、 樣本測定：
試劑名稱（μL） | 基質管 | 對照管 | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | - | 20 | 20 | - | - |
蒸餾水 | 20 | 40 | - | - | - |
試劑一 | 40 | - | 40 | - | - |
試劑二 | 40 | 40 | 40 | - | - |
混勻后，25℃反應1h | - | - | |||
試劑三 | 40 | 40 | 40 | - | - |
充分震蕩30s，常溫靜置5min，取上清 | - | - | |||
上清液 | 70 | 70 | 70 | - | - |
標準品 | - | - | - | 70 | - |
蒸餾水 | - | - | - | - | 70 |
工作液 | 140 | 140 | 140 | 140 | 140 |
充分混勻，常溫靜置5min，于微量玻璃比色皿或96孔板中測定540nm各管吸光值，分別記為A基質管、A對照管、A測定管、A標準管和A空白管，計算ΔA測定=A基質管-（A測定管-A對照管），ΔA標準=A標準管-空白管。空白管、標準管和基質管只需測1-2次，每個測定管需設一個對照管。 | |||||
三、亞硝酸還原酶活性計算
1. 標準曲線的繪制
以標準溶液濃度為x軸（x，μmol/mL），標準溶液對應的ΔA標準為y軸（y，ΔA標準），建立標準曲線，得到標準方程y=kx+b，將ΔA測定帶入方程得到x（μmol/mL）。
2. 酶活計算
（1）按照蛋白濃度計算
酶活單位定義：每mg組織蛋白每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（U/mg prot）=x×V1÷V2×V提÷（Cpr×V提）÷T=x×7÷Cpr
（2）按照樣本質量計算
酶活單位定義：每g組織每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（U/g 質量）=x×V1÷V2×V提÷W÷T=x×7÷W
（3）按照細菌/細胞數(shù)量計算
酶活單位定義：每104個細菌/細胞每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（U/104 cell）=x×V1÷V2×V提÷細菌/細胞數(shù)量÷T=x×7÷細菌/細胞數(shù)量
V1：取上清液前的反應體系體積，0.14mL；V2：加入的樣本體積，0.02mL；V提：加入的提取液體積，1.0mL；T：反應時間，1h；W：土樣質量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；細菌/細胞數(shù)量：以104計。
實驗實例：
1、 取0.1g楊樹葉片加入1mL提取液進行勻漿研磨，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定= A基質管-（A測定管-A對照管）=0.863-（0.705-0.065）=0.223，帶入標準曲線y=8.4313x+0.003，R2=0.9999，計算x=0.0261，按樣本質量計算酶活得：
NiR（U/g 質量）=x×7÷W=0.0261×7÷0.1=1.827 U/g 質量。
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