過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC0205

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中，使用前需先離心。

2、 檢測工作液的配制：
A. 使用96孔UV板：取試劑二25 μL中加入5mL試劑一，充分混勻，作為工作液（約26T），現(xiàn)用現(xiàn)配；也可根據(jù)樣本量按比例配制（提供1個15 mL空瓶）。
B. 使用微量石英比色皿：取試劑二25 μL中加入6.5mL試劑一，充分混勻，作為工作液（約34T），現(xiàn)用現(xiàn)配；也可根據(jù)樣本量按比例配制（提供1個15 mL空瓶）。

產(chǎn)品說明：

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是最主要的H₂O₂清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

H₂O₂在240nm下有特征吸收峰，CAT能夠分解H₂O₂，使反應溶液240nm下的吸光度隨反應時間而下降，根據(jù)吸光度的變化率可計算出CAT活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、細菌、細胞或組織樣本的制備：

a、細菌或培養(yǎng)細胞：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬細菌或細胞加入1mL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

b、組織：按照組織質(zhì)量（g）：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣本：直接檢測。

二、測定步驟

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至240nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 測定前將CAT檢測工作液在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

3、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液，立即混勻并計時，記錄240nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。計算ΔA=A1-A2。

三、CAT活性計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）CAT活力的計算：

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/mL)= [ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷V樣÷T=459×ΔA

2、組織、細菌或細胞中CAT活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷(Cpr×V樣) ÷T=459×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/g 質(zhì)量)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷（V樣÷V樣總×W）÷T=459×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞數(shù)量計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷（V樣÷V樣總×500）÷T =0.917×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4L；ε：H₂O₂摩爾消光系數(shù)，43.6 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，1min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬；10⁶：單位換算系數(shù)，1mol=10⁶μmol。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）CAT活力的計算：

單位的定義：每mL血清（漿）在反應體系中每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/mL)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷V樣÷T=764.5×ΔA

2、組織、細菌或細胞中CAT活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷(Cpr×V樣) ÷T =764.5×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算：

單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/g 質(zhì)量)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷（V樣÷V樣總×W）÷T=764.5×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞數(shù)量計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷（V樣÷V樣總×500）÷T=1.529×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4L；ε：H₂O₂摩爾消光系數(shù)，43.6 L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.6cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，1min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬；10⁶：單位換算系數(shù)，1mol=10⁶μmol。

注意事項：

如果反應液有大量氣泡產(chǎn)生，將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定。

相關發(fā)表文獻：

[1] Zhang Z, Liu H, Sun C, et al. A C2H2 zinc-finger protein OsZFP213 interacts with OsMAPK3 to enhance salt tolerance in rice[J]. Journal of plant physiology, 2018, 229: 100-110.

[2] Yin Y J, Chen C J, Guo S W, et al. The fight against Panax notoginseng root-rot disease using zingiberaceae essential oils as potential weapons[J]. Frontiers in plant science, 2018, 9: 1346.

[3] Yang Y, Li J, Wei C, et al. Amelioration of nonalcoholic fatty liver disease by swertiamarin in fructose-fed mice[J]. Phytomedicine, 2019, 59: 152782.

[4] Chen G, Jia Z, Wang L, et al. Effect of acute exposure of saxitoxin on development of zebrafish embryos (Danio rerio) [J]. Environmental Research, 2020: 109432.

參考文獻：

[1] Catalase in vitro. [J]. Methods Enzymol, 105:121-126.

[2] Johansson L H, Borg L A H. A spectrophotometric method for determination of catalase activity in small tissue samples[J]. Analytical biochemistry, 1988, 174(1): 331-336.

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