目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC5525乙酰乳酸合成酶活性檢測試劑盒 微量法
CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
---|---|---|---|
分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T/24S 100T/48S |
貨號 | BC5525 | 應用領域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
主要用途 | 乙酰乳酸合成酶活性檢測 |
乙酰乳酸合成酶(ALS)活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號:BC5525
規(guī)格:50T/24S、100T/48S
產(chǎn)品內(nèi)容:使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 50T規(guī)格 | 100T規(guī)格 | 保存條件 |
試劑一A | 粉劑×1支 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑一B | 粉劑×1支 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑一C | 液體120mL×1瓶 | 液體120mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體15mL×1瓶 | 液體30mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三A | 粉劑×1支 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑三B | 粉劑×1支 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑三C | 液體60mL×1瓶 | 液體60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體1.6mL×1支 | 液體3mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 液體8mL×1瓶 | 液體12mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑六 | 粉劑×1瓶 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑六稀釋液 | 液體8mL×1瓶 | 液體15mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1mL×1支 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
50T溶液的配制:
1、 試劑一:臨用前將試劑一A,試劑一B溶于試劑一C中,充分溶解。未用完的試劑分裝保存,-20℃保存可以保存4周,避免反復凍融。
2、 試劑三:臨用前將試劑三A,試劑三B溶于試劑三C中,充分溶解。未用完的試劑分裝保存,-20℃保存可以保存4周,避免反復凍融。
3、 試劑六:臨用前加入1mL無水乙醇溶解。-20℃可保存4周。
4、 試劑六工作液:臨用前根據(jù)樣本量按試劑六:試劑六稀釋液=0.1mL:0.7mL(共0.8mL,8T)的比例配制,現(xiàn)用現(xiàn)配。當天用完。
5、 標準品:100μmol/mL 乙偶姻標準液(即105 nmol/mL 乙偶姻標準液)。
6、 100nmol/mL標準溶液的配制:取105 nmol/mL 乙偶姻標準液50μL和950μL蒸餾水混合,即5000nmol/mL標準溶液;再取20μL 5000nmol/mL標準溶液和980μL蒸餾水混合,即100nmol/mL標準溶液。
100T溶液的配制:
1、 試劑一:臨用前將試劑一A,試劑一B加入試劑一C中,充分溶解。未用完的試劑分裝保存,-20℃保存可以保存4周,避免反復凍融。
2、 試劑三:臨用前將試劑三A,試劑三B溶于試劑三C中,充分溶解。未用完的試劑分裝保存,-20℃保存可以保存4周,避免反復凍融。
3、 試劑六:臨用前加入2mL無水乙醇溶解。-20℃可保存4周。
4、 試劑六工作液:臨用前根據(jù)樣本量按試劑六:試劑六稀釋液=0.1mL:0.7mL(共0.8mL,8T)的比例配制,現(xiàn)用現(xiàn)配。當天用完。
5、 標準品:100μmol/mL 乙偶姻標準液(即105 nmol/mL 乙偶姻標準液)。
6、 100nmol/mL標準溶液的配制:取105 nmol/mL 乙偶姻標準液50μL和950μL蒸餾水混合,即5000nmol/mL標準溶液;再取20μL 5000nmol/mL標準溶液和980μL蒸餾水混合,即100nmol/mL標準溶液。
產(chǎn)品說明:
乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase,ALS,EC 4.1.3.18),又稱乙酰羥基酸合成酶(Acetohydroxyacid synthase,AHAS)。ALS存在于植物生長的過程中,是誘導支鏈氨基酸(Ile、Leu、Val)生物合成過程中第一階段的關鍵酶。
ALS催化丙酮酸生成乙酰乳酸,乙酰乳酸在一定條件下脫羧生成乙偶姻,乙偶姻在堿性環(huán)境下與肌酸和α-萘酚反應生成紅色物質,在525nm下有最大吸光值。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、蒸餾水、病、無水乙醇和硫酸銨。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
1. 按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:2~4的比例(建議稱取約0.5g到1g組織,加入試劑一定容至2mL),進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心20min。取1mL上清,轉移至新的2mL EP管中。
2. 在取出的上清中加入約0.5g硫酸銨,充分溶解后4℃靜置2h。然后15000g 4℃離心20min,棄掉上清。沉淀中加入0.5mL試劑二,充分溶解冰上待用(若按蛋白濃度計算,則用此粗酶液自行測定蛋白濃度)。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至525nm,可見分光光度計用蒸餾水調(diào)零。
4、在1.5mLEP管中按下表步驟加樣:
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 標準空白管 |
樣本 | 200 | 200 | - | - |
試劑三 | 200 | 200 | - | - |
試劑四 | - | 20 | - | - |
37℃避光反應1小時 | ||||
試劑四 | 20 | - | - | - |
充分混勻,60℃反應15min,取出后8000g離心5min,取上清于新的EP管中 | ||||
上清液 | 200 | 200 | - | - |
標準品 | - | - | 200 | - |
蒸餾水 | - | - | - | 200 |
試劑五 | 100 | 100 | 100 | 100 |
試劑六工作液 | 100 | 100 | 100 | 100 |
充分混勻,60℃反應15min,然后取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板中,測定525nm處吸光值,記作A測定,A對照,A標準,A標準空白。?A測定=A測定-A對照,?A標準=A標準-A標準空白。(標準管和標準空白管只需做1-2次) |
三、乙酰乳酸合成酶活性計算
按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:37℃每mg組織蛋白每小時催化產(chǎn)生1nmol乙酰乳酸定義為一個酶活力單位。
ALS活性(U/mg prot)= C標準×?A測定÷?A標準×V酶促÷(Cpr×V樣)÷T×F= 2.1×x÷Cpr×F
按樣本質量計算
單位的定義:37℃每g組織每小時催化產(chǎn)生1nmol乙酰乳酸定義為一個酶活力單位。
ALS活性(U/g 質量)= C標準×?A測定÷?A標準×V酶促÷(W÷2÷V提取×V樣)÷T×F= x×2.1÷W×F
V酶促:37℃反應體系體積,0.42mL;V提取:加入的試劑三體積,0.5mL;V樣:加入的樣本體積,0.2mL;T:37℃反應時間,1h;Cpr:蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;2:2mL 樣本勻漿取1mL;F:樣本稀釋倍數(shù)。
注意事項:
1、 如果?A測定大于1,可以對樣品進行稀釋或者縮短37℃反應時間;測定吸光值或?A測定小于0.01,可以加大樣本量或者延長37℃反應時間。最終計算時同步修改計算公式。
實驗實例:
稱取0.5037g胡蘿卜組織,按照前處理步驟操作進行提取酶液,按照測定步驟操作,用96孔板測得計算?測定=A測定-A對照=0.308-0.198=0.11,?A標準=A標準-A標準空白=0.671-0.173=0.498,帶入公式計算:
ALS活性(U/g 質量)= 210×?A測定÷?A標準÷W×F=92.090 U/g 質量
參考文獻:
[1] George, MouradJohn, King. Effect of four classes of herbicides on growth and acetolactate-synthase activity in several variants of Arabidopsis thaliana[J]. Planta, 1992, 188(4):491-497.
[2] Hwang I T , Ko Y K , Kim T J , et al. Structure–Activity Relationships of Acetolactate Synthase Inhibition among New Benzenesulfonylureas in Rice (Oryza sativa) and Barnyardgrass (Echinochloa crus-galli var. oryzicola)[J]. Pesticide Biochemistry & Physiology, 2000, 68(3):166-172.
相關系列產(chǎn)品:
BC4160/BC4165 脯*酸脫氫酶(RroDH)活性檢測試劑盒
BC4140/BC4145 亮*酸氨基肽酶(LAP)活性檢測試劑盒
BC4400/BC4405 鳥*酸轉氨酶(δ-OAT)活性檢測試劑盒
乙酰乳酸合成酶活性檢測試劑盒 微量法 乙酰乳酸合成酶活性檢測試劑盒 微量法