目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測(cè)試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC0385丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測(cè)試劑盒 微量法
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更新時(shí)間:2024-08-02 10:04:30瀏覽次數(shù):2583評(píng)價(jià)
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CAS | 詳詢客服 | 純度 | 詳詢客服 |
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分子量 | 詳詢客服 | 分子式 | 詳詢客服 |
供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100T/96S |
貨號(hào) | BC0385 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
主要用途 | 丙酮酸脫氫酶活性測(cè)定 |
丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測(cè)試劑盒說明書 微量法
注意:本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng),請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號(hào):BC0385
規(guī)格:100T/96S
產(chǎn)品組成:使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。
丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測(cè)試劑盒 微量法
丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測(cè)試劑盒 微量法
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體0.6 mL×2支 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體7.5mL×2瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體13mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑六 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑七 | 液體4mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
1. 試劑二:為易揮發(fā)試劑,用完后盡快密封,-20℃保存。
2. 工作液的配制:臨用前把5.75mL試劑四、一支試劑五、0.45mL試劑六、1.75mL試劑七轉(zhuǎn)移到一瓶試劑三中混合溶解待用(共15.45mL,約85T);用不完的試劑-20℃分裝保存,可保存4周。避免反復(fù)凍融。
產(chǎn)品說明:
PDH(EC 4.1.1.1)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶,催化丙酮酸脫梭,把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來。
PDH催化丙酮酸脫氫,同時(shí)還原2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP),從而導(dǎo)致605nm光吸收的減少。
Pyruvic Acid + Thiamine Pyrophosphate Hydroxyethyl Thiamine Pyrophosphate
Dichlorophenolindophenol(605nm) + Hydroxyethyl Thiamine Pyrophosphate Reduced Dichlorophenolindophenol
注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))
1. 組織:稱取約 0.1g 組織,加入1mL 試劑一和 10μL試劑二,用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨,4 ℃ 11000g離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)胞或者細(xì)菌樣本:先收集500萬細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),離心后棄上清;之后加入1mL試劑一和 10μL試劑二,冰浴超聲波破碎細(xì)菌(功率200 W,超聲3 s,間隔7 s,總時(shí)間5 min);然后11000g,4℃,離心10 min,
取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清(漿)及其它液體樣本:直接檢測(cè)。若溶液有渾濁則離心后去上清進(jìn)行測(cè)定。
二、測(cè)定步驟
1、 可見分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至605nm,分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。
2、 每個(gè)樣本需要180μL工作液,根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需取出一定量的工作液置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴鍋中水浴10min。
3、 空白管:在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL水,混勻,立即記錄605nm處10s處吸光值A1和 1min10s后的吸光值A2,計(jì)算ΔA空白=A1-A2。空白管只需測(cè)1-2次。
4、 測(cè)定管:在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL樣本,混勻,立即記錄605nm處10s處吸光值A3和1min10s后的吸光值A4,計(jì)算ΔA測(cè)定=A3-A4。
三、PDH活性計(jì)算
a.用微量比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(U/mg prot)=[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反總×109]÷(Cpr×V樣) ÷T
=904.762×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷Cpr
2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算
單位的定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(U/g 質(zhì)量)=[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反總×109]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T
=913.81×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷W
3. 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(U/104 cell)=[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V樣總×500)÷T
=1.828×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)
4. 按樣本體積計(jì)算
單位的定義:每mL液體在反應(yīng)體系中每分鐘消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(U/mL)=[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T
=904.762×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)
V反總:反應(yīng)體系總體積,1.9×10-4L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01mL;V樣總:加入試劑一和試劑二體積,1.01mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1.按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(U/mg prot)=[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣) ÷T
=1809.524×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷Cpr
2.按樣本質(zhì)量計(jì)算
單位的定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(U/g 質(zhì)量)=[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T
=1827.62×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷W
3.按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(U/104 cell)=[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T
=3.655×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)
4.按樣本體積計(jì)算
單位的定義:每mL液體在反應(yīng)體系中每分鐘消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。
PDH活性(U/mL)=[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T
=1809.524×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)
V反總:反應(yīng)體系總體積,1.9×10-4L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L/mol/ cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01mL;V樣總:加入試劑一和試劑二體積,1.01mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
注意事項(xiàng):
1、測(cè)定過程中所有樣本在冰上放置并于2小時(shí)內(nèi)檢測(cè),以免變性和失活。
2、測(cè)定管的ΔA值在0.01-0.25之間,若測(cè)定管的ΔA值大于0.25,需將樣本進(jìn)行稀釋。計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。若測(cè)定管的ΔA值小于0.01,需加大樣本量后重新測(cè)定,注意同步修改計(jì)算公式。
3、由于試劑一中含有一定濃度的蛋白(約1mg/mL),所以在測(cè)定樣品蛋白濃度時(shí)需要減去試劑一的蛋白含量。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例:
1、 取0.1g小鼠肝臟加入1mL試劑一和10μL試劑二,用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨,4℃、11000g離心10min,取上清置冰上,按照測(cè)定步驟操作,用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A3-A4=1.3106-1.1183=0.1923,ΔA空白=A1-A2 =1.3325-1.3314=0.0011,按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得:
PDH活性(U/g質(zhì)量)= 913.81×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷W=1747 U/g質(zhì)量。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn):
[1] Peng S, Wang Y, Zhou Y, et al. Rare ginsenosides ameliorate lipid overload-induced myocardial insulin resistance via modulating metabolic flexibility[J]. Phytomedicine, 2019, 58: 152745.
參考文獻(xiàn):
[1] Guitart M, Andreu A L, García-Arumi E, et al. FATP1 localizes to mitochondria and enhances pyruvate dehydrogenase activity in skeletal myotubes[J]. Mitochondrion, 2009, 9(4): 266-272.
相關(guān)系列產(chǎn)品:
BC0710/BC0715 α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)活性檢測(cè)試劑盒
BC2150/BC2155 檸檬酸(CA)含量檢測(cè)試劑盒
BC0950/BC0955 琥珀酸脫氫酶(SDH)活性檢測(cè)試劑盒
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