氨芐青霉素快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氨芐青霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氨芐青霉素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氨芐青霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物氨芐青霉素的含量。
二、試劑盒特性
試劑盒靈敏度： 0.1ppb
孵育溫度： 25℃
孵育時間： 30min～30min～15min
樣本檢測下限
組織、蜂蜜、牛奶 2ppb
蜂蜜、牛奶樣本因存在一定的干擾，定量檢測下限為4ppb
交叉反應(yīng)率
氨芐青霉素 100%
青 霉 素 0.8%
鄰氯青霉素 0.2%
雙氯青霉素 0.1%
阿莫西林 0.1%
頭孢塞呋 0.1%
樣本回收率
組 織 75±19%
蜂蜜 、牛奶 70±17%
三、試劑盒組成
1、微量測試孔：每條8孔，一板12條
2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶（1ml/瓶）： 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
3、酶標(biāo)記物 12ml 紅色帽
4、抗體工作液 7ml 藍(lán)色帽
5、底物A液 7ml 白色帽
6、底物B液 7ml 黑色帽
7、終止液 7ml 黃色帽
8、20X濃縮洗滌液 40ml 白色帽
9、5X濃縮復(fù)溶液 50ml 透明帽
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、刻度移液管
微量移液器：單道 20µl～200µl、單道100µl～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：氫氧化鈉、乙腈、正己烷、亞硝基鐵氰化na、硫酸鋅
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
樣本前處理需配制：
配液1 C液（牛奶、奶粉樣本）：
10.7g 亞硝基鐵氰化na加去離子水100ml溶解。
配液2 D液（牛奶、奶粉樣本）：
28.8g硫酸鋅加去離子水100ml溶解。
配液3 0.1M NaOH溶液
0.4gNaOH加去離子水100ml溶解。
配液4 乙腈-0.1M NaOH溶液
84ml乙腈16ml 0.1M NaOH混合均勻
配液5 樣本復(fù)溶液：
將5X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：4稀釋。
配液6 1M NaOH溶液
4g NaOH加去離子水100ml溶解
樣本處理：
（a）組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚)樣本處理方法
1、稱取2±0.05g均質(zhì)后樣本于50ml離心管中，加入2ml 1M NaOH溶液，渦旋2min，再加入8ml乙腈振蕩5min，室溫4000r/min以上離心10min；
2、取出1ml上清液，在56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥；
3、加入1 ml樣本復(fù)溶液溶解干燥殘留物，混合30s；將溶解后的樣本液按1：3（50µl樣本液加150µl樣本復(fù)溶液）稀釋，混合30s；
4、取50 µl用于分析
樣本稀釋倍數(shù): 20倍
（b）蜂蜜處理方法
1、準(zhǔn)確稱取1±0.05g蜂蜜樣本于離心管中，加入3ml 樣本復(fù)溶液，振蕩混勻后靜置20min；室溫4000r/min 以上離心10min；
2、取上層液體用樣本復(fù)溶液按1：4（20µl樣本液+80µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋，混合30s；
3、取50µl用于分析
樣本稀釋倍數(shù): 20倍
（c） 牛奶樣本處理方法一
1、取2ml鮮牛奶于5ml離心管，加入50µlC液混勻；
2、加入50 µl D液振蕩1min，10℃ 4000r/min以上離心10min；
3、取上層清亮液體用樣本復(fù)溶液按1： 19（20µl樣本液+380µl樣本復(fù)溶液）稀釋，混合30s；
4、取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：20
注：如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過程。
（d）牛奶樣本處理方法二
1、取2ml去除脂肪奶樣至離心管中；
2、加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min，取1ml上清液，在56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥；
3、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml樣本復(fù)溶液混合30s，離心去除正己烷相；
4、取下層相用樣本復(fù)溶液按1：3 （50µl樣本液加150µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋，混合30s；
5、取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 20倍
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
測定前應(yīng)須知：
1、使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2、使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
操作步驟：
1、從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、配液：將40ml 20X濃縮洗滌液用去離子水稀釋至800ml。
4、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
8、顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
9、測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含氨芐青霉素量成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.1ppb為1.816；0.3ppb為1.415；0.9ppb為0.74；2.7ppb為0.313；8.1ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb～8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氨芐青霉素實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝ B ×100%
B0
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氨芐青霉素實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。八、 注意事項
1、室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、該試劑盒zui佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
2、保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
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