單程細(xì)胞具有復(fù)雜生物學(xué)性質(zhì)，它們通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)ECM形成緊密的細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞與細(xì)胞連接，諸如上皮細(xì)胞通過(guò)這種特殊的鏈接方式構(gòu)成了屏障層保護(hù)人體免受外界損傷。因此細(xì)胞之間以及細(xì)胞基底的粘附力測(cè)定對(duì)于研究細(xì)胞粘附蛋白的機(jī)制有著重要意義。使用力學(xué)工具測(cè)量細(xì)胞間以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附力始終不是一件容易的事情。首先，由于細(xì)胞與基質(zhì)的作用力僅為nN級(jí)別，因此需要力學(xué)精度較高的設(shè)備才能夠測(cè)量，而且在這其中較為適合的工具為原子力顯微鏡（AFM）。原子力顯微鏡能夠提供納米級(jí)別的操作精度并可測(cè)量從pN~nN范圍的力譜。但是受制于AFM探針本身的限制，需要借助修飾手段才能夠讓細(xì)胞與探針固定到一起，這個(gè)過(guò)程十分繁瑣，并且由于需要大量手工操作很難實(shí)現(xiàn)高通量的測(cè)量。而不同的細(xì)胞由于細(xì)胞異質(zhì)性使得要想確定粘附力需要較多樣本才能獲得相對(duì)準(zhǔn)確的值，無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)量直接限制了原子力探針在細(xì)胞粘附力上的應(yīng)用。

而多功能單細(xì)胞顯微操作FluidFM技術(shù)的出現(xiàn)改變了這一現(xiàn)狀，它使用特殊的中空探針能夠輕松地通過(guò)負(fù)壓抓取細(xì)胞，取得和AFM近似精度的數(shù)據(jù)，無(wú)需在探針上進(jìn)行任何修飾，不會(huì)改變細(xì)胞表面的任何通路，從而能夠得到接近細(xì)胞原生的數(shù)據(jù)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后能夠通過(guò)正壓快速丟棄用過(guò)的細(xì)胞，具備很高的自動(dòng)化，能夠快速測(cè)量細(xì)胞粘附力。

使用FluidFM對(duì)細(xì)胞操作的基本流程

FluidFM在粘附力測(cè)量上具備顯著優(yōu)勢(shì)。如圖所示，F(xiàn)luidFM能夠通過(guò)負(fù)壓將細(xì)胞吸附到原子力探針的末端，通過(guò)高精度位移臺(tái)的控制將細(xì)胞從基底上分離，并且同時(shí)記錄FD曲線。通過(guò)FD曲線能夠獲得最大粘附力Fmax和粘附能量Emax。通過(guò)高度自動(dòng)化的控制系統(tǒng)能夠在短時(shí)間內(nèi)測(cè)量大量細(xì)胞粘附力，評(píng)估細(xì)胞群體分布以及細(xì)胞間差異，并且可有效避免傳統(tǒng)粘附力測(cè)量因準(zhǔn)備時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而錯(cuò)過(guò)最佳測(cè)量時(shí)間導(dǎo)致的細(xì)胞粘附力改變，得到更為精準(zhǔn)的結(jié)果。近期，Agoston等人使用多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM實(shí)現(xiàn)了高通量細(xì)胞粘附力測(cè)量，對(duì)同種細(xì)胞不同區(qū)以及不同細(xì)胞之間的粘附力進(jìn)行測(cè)量和比較。

作者首先對(duì)Vero和Hela細(xì)胞在不同狀態(tài)下的粘附力進(jìn)行了測(cè)量和比較，總共測(cè)量了214個(gè)細(xì)胞。通過(guò)比較明膠涂層上處于單個(gè)細(xì)胞、孤島狀細(xì)胞、致密連接細(xì)胞以及單層細(xì)胞上游離細(xì)胞之間的粘附力，能夠明顯觀測(cè)到Vero細(xì)胞處于致密連接的細(xì)胞粘附力最大，大概在750 nN左右，隨著細(xì)胞單細(xì)胞層的稀疏，細(xì)胞粘附力有所下降，而處于細(xì)胞層頂部的細(xì)胞粘附力低至僅為50 nN左右。這一點(diǎn)充分說(shuō)明上皮細(xì)胞能夠在細(xì)胞之間形成緊密的連接，而處于細(xì)胞層外的細(xì)胞則幾乎沒(méi)有粘附力。而對(duì)于HeLa這樣的腫瘤細(xì)胞測(cè)量的結(jié)果卻顯示出了截然不同的結(jié)果，處于不同狀態(tài)的細(xì)胞有著近似的粘附力，基本都在200 nN左右，這與處于單個(gè)游離上皮細(xì)胞的粘附力十分接近，表明HeLa細(xì)胞在不同環(huán)境下仍然具有較高遷徙能力。

使用FluidFM對(duì)不同區(qū)域細(xì)胞的FD曲線測(cè)定結(jié)果和對(duì)比

通過(guò)對(duì)這兩種細(xì)胞的最大粘附力、最大粘附能量、最大拉伸距離和細(xì)胞接觸面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可以發(fā)現(xiàn)，HeLa腫瘤細(xì)胞在粘附力和粘附能量上均有所降低，但是當(dāng)HeLa細(xì)胞形成了單層后，兩者區(qū)別不大。

對(duì)比Hela和Vero在不同生長(zhǎng)狀態(tài)下的最大粘附力、最大粘附能量、粘附拉伸距離和粘附面積。

再進(jìn)一步對(duì)Vero與HeLa細(xì)胞最大粘附力與距離和接觸面積進(jìn)行對(duì)比，依然可以得到與單獨(dú)比較粘附力相同的結(jié)果，并且最大能量與細(xì)胞接觸面積的比值中也存在著類似的結(jié)果。由此可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞通過(guò)降低自身粘附力從而獲得了更好的遷移能力。

對(duì)不同狀態(tài)Vero和A549之間的粘附力/粘附距離、粘附力/粘附面積、粘附能量/粘附面積

總結(jié)

細(xì)胞粘附力測(cè)定在細(xì)胞生命科學(xué)研究中起著至關(guān)重要的作用，然而傳統(tǒng)手段中有著各種各樣的局限性，主要原因是缺乏一種有效抓取細(xì)胞并進(jìn)行力學(xué)測(cè)定的手段?，F(xiàn)如今FluidFM技術(shù)在細(xì)胞粘附力測(cè)定中的應(yīng)用，使得研究者們有了一種能夠有效、低損的方式抓取細(xì)胞，配合原子力顯微鏡精確測(cè)量的特性，真正意義上做到精準(zhǔn)、無(wú)損、快速的測(cè)量單細(xì)胞粘附力，幫助研究者尋找細(xì)胞粘附力與細(xì)胞生命發(fā)展、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

【參考文獻(xiàn)】

[1] A. Sancho, M. B. Taskin, L. Wistlich, P. Stahlhut, K. Wittmann, A. Rossi & J. Groll. Cell Adhesion Assessment Reveals a Higher Force per Contact Area on Fibrous Structures Compared to Flat Surfaces. ACS Biomater. Sci. Eng. 2022, 8, 2, 649–658.

[2] P.W. Doll, K. Doll, A. Winkel, R. Thelen, R. Ahrens, M. Stiesch & A.E. Guber. Influence of the Available Surface Area and Cell Elasticity on Bacterial Adhesion Forces on Highly Ordered Silicon Nanopillars. ACS Omega. 2022, 7, 21, 17620–17631.

[3] Sankaran, S. Jaatinen, L. Brinkmann, J. Zambelli, T. V?r?s, J. Jonkheijm, P. Cell adhesion on dynamic supramolecular surfaces probed by fluid force microscopy-based single-cell force spectroscopy. ACS Nano 2017, 11, 3867–3874.

[4] Sancho, A. Vandersmissen, I. Craps, S. Luttun, A. Groll, J. A new strategy to measure intercellular adhesion forces in mature cell-cell contacts. Sci. Rep. 2017, 7, 46152.

[5] Ines, Lüchtefeld. Alice, Bartolozzi. Julián M. M. Oana, Dobre. Michele, Basso. Tomaso, Zambelli. Massimo, Vassalli. Elasticity spectra as a tool to investigate actin cortex mechanics. J Nanobiotechnol. 2020, 18, 147.

[6] Dehullu, J. Valotteau, C. Herman-Bausier, P. Garcia-Sherman, M. Mittelviefhaus, M. Vorholt, J. A. Lipke, P. N. Dufrene, Y. F. Fluidic force microscopy demonstrates that homophilic adhesion by Candida albicans Als proteins is mediated by amyloid bonds between cells. Nano Lett. 2019, 19, 3846–3853.

[7] Mittelviefhaus, M. Müller, D. B. Zambelli, T. Vorholt, J. A. A modular atomic force microscopy approach reveals a large range of hydrophobic adhesion forces among bacterial members of the leaf microbiota. ISME J. 2019, 13, 1878–1882.

[8] F. Weigl, C. Blum, A. Sancho & J. Groll. Correlative Analysis of Intra- versus Extracellular Cell Detachment Events vis the Alignment of Optical Imaging and Detachment Force Quantification. Adv. Mater. Technol. 2022, 2200195.

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