色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)在分析方法使用中的重要性

本文主要以ICHQ2 指導(dǎo)原則為基礎(chǔ)，對(duì)比了各國(guó)藥典對(duì)色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的論述及要求，提出了我國(guó)目前在分析方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證過(guò)程中，存在對(duì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)認(rèn)識(shí)和研究的不足。

色譜作為快速、準(zhǔn)確、可靠的分析方法，在各國(guó)藥典中得到廣泛應(yīng)用。色譜方法一般包括紙色譜、薄層色譜、氣相色譜、液相色譜、離子色譜、分子排阻色譜、毛細(xì)管電泳等。隨著對(duì)色譜法研究和應(yīng)用的不斷深入，越來(lái)越多的研究者意識(shí)到色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)在色譜分析方法中的重要性，尤其是對(duì)試驗(yàn)條件( 流動(dòng)相、不同品牌或不同批號(hào)色譜柱、不同品牌儀器) 較為敏感的分析方法。

1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的定義

ICHQ2［1］中關(guān)于系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的論述為: 許多分析方法的必要組成部分。該試驗(yàn)是把分析設(shè)備、電子儀器、實(shí)驗(yàn)操作和被分析樣品作為一個(gè)整體來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)參數(shù)是根據(jù)被論證的方法類型，針對(duì)某一特定方法而建立的。通常通過(guò)耐用性評(píng)估，建立一系列系統(tǒng)適用性參數(shù)(如分離度試驗(yàn)) ，以確保該分析方法在任何時(shí)候使用均有效。BP 2018 輔助章節(jié)( supplementarychapter) SCⅢF．［2］分析方法驗(yàn)證部分內(nèi)容對(duì)系統(tǒng)適用性的論述與ICHQ2B 基本一致。USP 41 通則<1225>［3］藥典方法的驗(yàn)證中，對(duì)系統(tǒng)適用性的論述為: 如果測(cè)試易受測(cè)試條件變化的影響，應(yīng)當(dāng)對(duì)方法進(jìn)行合理控制或是指明注意事項(xiàng)。評(píng)估耐用性就是確立一系列系統(tǒng)適用性參數(shù)，以確保不論何時(shí)使用，均可維持分析方法的有效性。

液相色譜典型的變動(dòng)因素有被測(cè)溶液的穩(wěn)定性、不同儀器、不同分析人員、流動(dòng)相的pH值和組成、不同廠牌或批號(hào)的色譜柱、柱溫和流速。對(duì)于氣相色譜法而言，典型的變動(dòng)因素有不同批號(hào)或供應(yīng)商的色譜柱以及溫度、流速等。系統(tǒng)適用性必須基于儀器、電子元件、分析方法操作以及被測(cè)物是一個(gè)整體的系統(tǒng)。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的參數(shù)由所評(píng)價(jià)的分析方法決定。對(duì)于色譜法，系統(tǒng)適用性尤其重要，向USP提交的文件應(yīng)該注明符合色譜法621中常規(guī)測(cè)試章節(jié)中的有關(guān)系統(tǒng)適用性的要求。

《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版通則9101“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”［4］未對(duì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)進(jìn)行單獨(dú)論述，僅在耐用性項(xiàng)下提到:經(jīng)試驗(yàn)，測(cè)定條件小的變動(dòng)應(yīng)能滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求。

對(duì)比ICHQ2 以及各國(guó)藥典通則分析方法驗(yàn)證項(xiàng)下，BP2018 和USP41與ICHQ2 論述內(nèi)涵較為一致，建立系列系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求的目的是為了確保在任何時(shí)候使用該分析方法都是有效的。

2 系統(tǒng)適用性的要求

對(duì)比各國(guó)藥典色譜法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，內(nèi)容基本一致，均包括理論板數(shù)、分離度、拖尾因子、重復(fù)性和靈敏度。具體要求略有差異，《中華人民共和國(guó)藥典》色譜法項(xiàng)下系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求更加明確，但目前各論中收載的品種項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性要求卻是低的。美國(guó)藥典通則色譜法項(xiàng)下系統(tǒng)適用性要求并不明確，但在其各論中系統(tǒng)適用性要求卻是zui多體的。這一點(diǎn)也體現(xiàn)了中美研究者對(duì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)認(rèn)識(shí)和研究深度的差異。

《中華人民共和國(guó)藥典》通則0502薄層色譜法提到了系統(tǒng)適用性要求: ①比移值。除另有規(guī)定外，雜質(zhì)檢查時(shí)，各雜質(zhì)斑點(diǎn)的比移值Ｒf 以在0．2 ～ 0．8 之間為宜。②檢出限。自身對(duì)照溶液顯清晰可辨斑點(diǎn)的濃度或量為檢出限。③分離度除另有規(guī)定外都應(yīng)大于1．0。④相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，薄層色譜掃描含量測(cè)定時(shí)，同一供試品溶液在同一薄層板上平行點(diǎn)樣的待測(cè)成分的峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5．0%，需顯色后測(cè)定的或者異板的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于10． 0%。

通則0512液相法提到的系統(tǒng)適用性要求:①理論板數(shù)。應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)，一般為待測(cè)物質(zhì)或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。②分離度。除另有規(guī)定外，待測(cè)物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)大于1． 5。③靈敏度，定量測(cè)定時(shí)，信噪比不小于10，定性測(cè)定時(shí)，信噪比不小于3。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中可以設(shè)置靈敏度試驗(yàn)溶液，來(lái)評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)的檢測(cè)能力。④拖尾因子( T) 。除另有規(guī)定外，應(yīng)在0.95 ～1. 05 之間。⑤重復(fù)性。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。

離子色譜法、分子排阻色譜法( 分離度一般應(yīng)大于2.0) 、氣相色譜法、超臨界流體色譜法、臨界點(diǎn)色譜法等的系統(tǒng)適用性要求，除另有規(guī)定外，應(yīng)照液相色譜法項(xiàng)下的規(guī)定。

USP通則621色譜法規(guī)定的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求也包括理論板數(shù)、分離度、拖尾因子、重復(fù)性和靈敏度，但除100%含量測(cè)定重復(fù)性外，其他系統(tǒng)適用性參數(shù)均未給出明確規(guī)定。

BP2018附錄Ⅲ( Appendix Ⅲ) 色譜分離技術(shù)中對(duì)系統(tǒng)適用性要求也包括理論板數(shù)、分離度、拖尾因子、重復(fù)性和靈敏度。BP 也僅對(duì)對(duì)稱因子規(guī)定為0． 8 ～ 1． 5 之間，100% 含量測(cè)定重復(fù)性要求與USP41規(guī)定一致，未對(duì)其他系統(tǒng)適用性參數(shù)作明確規(guī)定。

重新審視一下系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的各參數(shù)，它們之間并非孤立的，而是相互影響、相互作用、相互關(guān)聯(lián)。分離度Ｒs 是柱效N的函數(shù); 拖尾因子與重復(fù)性直接相關(guān)，并在一定程度上影響分離度; 靈敏度是保證上述所有參數(shù)有意義的基礎(chǔ)。因此，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，應(yīng)該是一個(gè)整體的評(píng)價(jià)，而不是單獨(dú)對(duì)某一個(gè)參數(shù)的要求。即便是拖尾因子，《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版指出，除另有規(guī)定外，應(yīng)在0.95 ～1. 05 之間; BP2018 規(guī)定應(yīng)在0． 8 ～ 1． 5 之間。但在實(shí)際運(yùn)用過(guò)程中，并非所有系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求中拖尾因子都在上述范圍內(nèi)。在某些特殊情況下，是可以突破上述系統(tǒng)適用性的一般要求的。如USP41 收載的二甲雙胍片溶出度檢測(cè)方法3 中，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求為: 拖尾因子NMT2． 0，柱效NLT1 500。實(shí)驗(yàn)室工作曾經(jīng)進(jìn)行鹽酸二甲雙胍的溶出度研究工作。二甲雙胍在較大濃度檢測(cè)時(shí)，容易出現(xiàn)拖尾因子較大的情況。但是，拖尾因子較大不一定會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。只要經(jīng)過(guò)研究和驗(yàn)證，能滿足檢測(cè)要求，能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，就算是超過(guò)BP拖尾因子要求0． 8 ～ 1． 5 的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)也是可以的。所以，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)作為分析方法*的一部分，應(yīng)該是結(jié)合分析方法本身一起來(lái)考慮。系統(tǒng)適用性要求應(yīng)該是以滿足分析方法檢測(cè)為目的。

3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的必要性

USP40 收載的谷胱甘肽有關(guān)物質(zhì)方法如下: 流動(dòng)相以磷酸鹽緩沖液( 取磷酸二氫鉀6． 8 g 與庚烷磺酸鈉2． 02 g，加水溶解并稀釋至1000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2． 8) -甲醇( 970∶30); 色譜柱為USPL1; 檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm; 柱溫為30℃; 流速為使谷胱甘肽保留時(shí)間約為5min; 進(jìn)樣量為10μL。

系統(tǒng)適用性溶液: 取谷胱甘肽對(duì)照品、抗壞血酸對(duì)照品和D-苯甘氨酸對(duì)照品各適量，加水溶解并稀釋制成每1mL 中約含谷胱甘肽0． 5 mg、抗壞血酸0． 5 mg 和D-苯甘氨酸0． 1 mg 的混合溶液作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。

系統(tǒng)適用性要求: 抗壞血酸與谷胱甘肽峰之間的分離度、谷胱甘肽與L-苯甘氨酸之間的分離度均不小于5，重復(fù)性不大于1． 5%。

根據(jù)谷胱甘肽的分子結(jié)構(gòu)，谷胱甘肽屬于在C18柱保留較弱的化合物，所以出峰時(shí)間較早，USP40 方法流動(dòng)相中采用了離子對(duì)試劑來(lái)增加保留，改善分離。然而，其保留時(shí)間也僅約為5min( 色譜柱規(guī)格:15cm × 4． 6 mm，5 μm，L1) 。某廠家谷胱甘肽注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中，其他色譜條件與USP40基本一致，規(guī)定調(diào)節(jié)流速使谷胱甘肽保留時(shí)間約為2min。分析出現(xiàn)上述差異的原因，主要有以下幾個(gè)方面: ①離子對(duì)試劑的質(zhì)量差異。②流動(dòng)相比例差異較大，由于操作而引入的系統(tǒng)誤差。③不同批號(hào)、型號(hào)色譜柱對(duì)谷胱甘肽色譜保留行為的差異。④不同品牌儀器設(shè)備等造成的差異等。通過(guò)對(duì)谷胱甘肽分析方法的分析以及實(shí)際的操作可知，此分析方法是屬于對(duì)試驗(yàn)條件較為敏感的方法。對(duì)于此類方法，可以對(duì)敏感的試驗(yàn)條件給予更加具體的規(guī)定。但對(duì)離子對(duì)試劑的來(lái)源、因流動(dòng)相比例差異大引入的系統(tǒng)誤差、不同品牌儀器等難以具體要求，即便色譜柱可以規(guī)定品牌和型號(hào)，但也會(huì)給后續(xù)的方法轉(zhuǎn)移和樣品檢測(cè)帶來(lái)了諸多不便。因此，谷胱甘肽有關(guān)物質(zhì)方法也未對(duì)上述條件乃至色譜柱加以規(guī)定?；谏鲜鲋T多問(wèn)題，谷胱甘肽有關(guān)物質(zhì)方法們終采用規(guī)定系統(tǒng)適用性試驗(yàn)參數(shù)的辦法來(lái)解決方法重復(fù)性的問(wèn)題，終方法的準(zhǔn)確性和精密度得到驗(yàn)證，方法得以被USP收載。

本文從USP41按順序查找了abacavirsulfate，abirateroneacetate，acebutololhydrochloride，acepromazinemaleate，acetaminophen，acetazolamide 和acetylcysteine的含量測(cè)定方法，上述含量測(cè)定方法均規(guī)定了系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求。

一般情況下，含量測(cè)定樣品溶液濃度水平較高，含量測(cè)定方法耐用性較好。但由《美國(guó)藥典》各項(xiàng)下實(shí)例可知，即便在這種情況下，絕大多數(shù)的含量測(cè)定方法仍然規(guī)定了系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求。由此可見(jiàn)，《美國(guó)藥典》對(duì)分析方法的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)尤為關(guān)注。

當(dāng)一個(gè)分析方法建立后，它可能會(huì)被不同人員，在不同時(shí)間、不同實(shí)驗(yàn)室、不同情況下使用，可能會(huì)發(fā)生許多異常或偏差。因此，為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要研究者在方法開(kāi)發(fā)初始，對(duì)上述情況作出一定的預(yù)判或者模擬，通過(guò)建立一系列的適用性參數(shù)來(lái)保證分析方法在任何情況下都有效。由此可見(jiàn)，對(duì)于分析方法而言，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)非常的重要。

4 總結(jié)與討論

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)作為分析方法不可分割的一部分，已經(jīng)被越來(lái)越多的監(jiān)管機(jī)構(gòu)所重視。藥品認(rèn)證合作組織( PIC/S) 在2007年頒布的制藥QC實(shí)驗(yàn)室GMP檢查指南中提出，進(jìn)行GMP檢查時(shí)涉及色譜方法系統(tǒng)適用性的檢查包括: ①檢查分析方法驗(yàn)證過(guò)程中，應(yīng)涉及是否開(kāi)發(fā)了系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，并對(duì)每一項(xiàng)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的參數(shù)進(jìn)行了定義，而且結(jié)果符合規(guī)定。②檢查分析儀器的確認(rèn)時(shí)，應(yīng)考察是否完整定義了系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及其可接受標(biāo)準(zhǔn)。在FDA網(wǎng)站上以“system suitability test warning letter”為主題詞進(jìn)行檢索，可以找到不少因?yàn)槲醋鱿到y(tǒng)適用性試驗(yàn)或者沒(méi)有按照要求做而導(dǎo)致制藥企業(yè)收到警告信的實(shí)例［5］。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)這方面的認(rèn)識(shí)也在逐漸的提升，這從《中華人民共和國(guó)藥典》2005 年版、2010 年版到2015年版的各論變化中可以體會(huì)到。但從目前國(guó)內(nèi)整體的藥物研發(fā)情況來(lái)看，分析方法們對(duì)此還沒(méi)有足夠的認(rèn)識(shí)。在大多數(shù)的自行開(kāi)發(fā)的分析方法中，未結(jié)合分析方法驗(yàn)證情況有針對(duì)性地去探索系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。在有藥典參考標(biāo)準(zhǔn)的情況下，對(duì)藥典標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)適用性要求不夠重視，僅僅將色譜條件拿來(lái)使用，或者隨意更改、降低系統(tǒng)適用性要求，導(dǎo)致方法的重現(xiàn)性差，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。在這方面，藥物分析工作者們急需提升觀念，提高重視程度，加強(qiáng)研究。