氨基酸分析方法

氨基酸分析法是指用于測(cè)定蛋白質(zhì)、肽及其他藥物制劑的氨基酸組成或含量的方法。
根據(jù)氨基酸組成分析可以對(duì)蛋白質(zhì)及肽進(jìn)行鑒別，氨基酸分析法可用于確定蛋白質(zhì)、肽及氨基酸的含量，及測(cè)定可能存在于蛋白質(zhì)及肽中的非典型氨基酸。進(jìn)行氨基酸分析前，必須將蛋白質(zhì)及肽水解成單個(gè)氨基酸，具體水解方法由各品種項(xiàng)下規(guī)定。蛋白質(zhì)及肽水解后，其氨基酸分析過程與用于其他藥物制劑中游離氨基酸的分析過程相同。
本法包括四種柱前衍生法，分別為異硫氰酸本酯（PITC）法、6-氨基喹啉－N－羥基琥珀酰亞氨基氨基JIA酸酯（AQC）法、鄰本二醛（OPA）和9-芴JIA基氯JIA酸JIA酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟本（DNFB）法，以及一種茚三酮柱后衍生法。不同的品種應(yīng)針對(duì)自身所含的氨基酸種類及各氨基酸的含量選擇適宜的氨基酸分析方法并做相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證。
由于本法衍生過程中衍生溶液量較少，且容易揮發(fā)，外標(biāo)法極易出現(xiàn)較大的誤差，建議采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定，內(nèi)標(biāo)的確定由各品種項(xiàng)下規(guī)定。在本法中，由于半胱氨酸或胱氨酸的衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，因此對(duì)于含半胱氨酸或胱氨酸的樣品衍生后應(yīng)盡快測(cè)定，或者在衍生前對(duì)半胱氨酸或胱氨酸進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚恚蛊滢D(zhuǎn)化為穩(wěn)定地產(chǎn)物（如磺基丙氨酸或半胱氨酸-硫代丙酸）后再衍生測(cè)定，具體方法由各品種項(xiàng)下規(guī)定。在測(cè)定過程中，可根據(jù)所用的儀器、色譜柱品牌、色譜柱的長(zhǎng)度及要分離的氨基酸種類，對(duì)流動(dòng)相的有機(jī)溶劑和洗脫梯度作適當(dāng)調(diào)整以獲得較好的分離度。
*法 PITC柱前衍生氨基酸分析法
本法系根據(jù)氨基酸與異硫氰酸本酯（PITC）反應(yīng)，生成有紫外響應(yīng)的氨基酸衍生物本氨基硫JIA酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸經(jīng)反相液相色譜分離后用紫外檢測(cè)，在一定的范圍內(nèi)其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為0.025～1.25µmol/ml。
試劑  （1）流動(dòng)相A    0.1mol/L醋酸鈉溶液（取無(wú)水醋酸鈉8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸調(diào)pH至6.5，然后加水至1000 ml）-乙腈（93:7）。
（2）流動(dòng)相B  乙腈－水（8：2）。
對(duì)照品溶液   按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法制備。
供試品溶液   按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法制備。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)  用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（SMA氨基酸分析色譜柱）；流速為每分鐘1.0ml；柱溫為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。各氨基酸峰間的分離度均應(yīng)大于1.0。洗脫梯度如下：
時(shí)間（min）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）
01000
148515
296634
300100
370100
37.11000
451000

測(cè)定法  精密量取氨基酸對(duì)照品溶液200μl，置一2ml塑料離心管中，精密加入1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，混勻，精密加入0.1mol/L異硫氰酸本酯乙腈溶液100μl，混勻，室溫放置1小時(shí)，加0.8ml正己烷，劇烈振搖，放置10min，精密取下層溶液2μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液200μl，自“置一2ml塑料離心管中”起同法測(cè)定。