CRISPR/Cas9系統(tǒng)逐漸成為作物育種的一種重要基因組編輯工具。雖然已有研究證明，目標(biāo)突變可以傳遞給下一代，但是它們的遺傳方式尚未*闡明。六月十九日，安徽省農(nóng)科院的研究人員在Nature子刊《Scientific Reports》發(fā)表題為“Generation of inheritable and “transgene clean" targeted genome-modified rice in later generations using the CRISPR/Cas9 system"的學(xué)術(shù)論文，描述了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的、四個不同水稻基因的基因組編輯。
本文通訊作者分別為安徽省農(nóng)科院院長楊劍波研究員和安徽省農(nóng)科院水稻研究所副研究員魏鵬程。楊劍波研究員早年畢業(yè)于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，1997年在中科院等離子體所獲博士學(xué)位，曾赴美國明尼蘇達(dá)大學(xué)研修植物生物技術(shù)，長期從事植物生物技術(shù)和輻射誘變的研究工作。主持承擔(dān)國家攻關(guān)、國家“863"計劃、科技部“973"項(xiàng)目、科技部支撐計劃、合作項(xiàng)目、農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)、農(nóng)業(yè)部科技成果轉(zhuǎn)化資金、安徽省重大科技攻關(guān)等多項(xiàng)科研課題。國內(nèi)外重要學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表研究論文100余篇，其中20篇被SCI收錄。
魏鵬程2008年博士畢業(yè)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008年至2011年分別在美國加州大學(xué)和佛羅里達(dá)大學(xué)從事博士后研究，主要從事作物生物技術(shù)應(yīng)用基礎(chǔ)和作物逆境響應(yīng)調(diào)控機(jī)理研究?，F(xiàn)為安徽省農(nóng)科院“主要農(nóng)作物基因調(diào)控元件分析和應(yīng)用"科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專家，安徽省“115"產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)“水稻分子育種團(tuán)隊(duì)"團(tuán)隊(duì)助理，入選安徽省第九批學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人選。發(fā)表SCI論文20多篇,其中以*作者或通訊作者在《Plant Physiology》《Plant Journal》《Plant Cell Environment》等刊物上發(fā)表論文十篇。
在作物中產(chǎn)生所需的基因多樣性，是基本功能基因組學(xué)研究和農(nóng)業(yè)分子育種的主要目標(biāo)。利用工程核酸酶的基因編輯，例如，鋅指核酸酶（ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN），可有效地在植物基因組的特定位點(diǎn)產(chǎn)生遺傳變異。這些核酸酶可誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂（DSBs），然后通過同源重組（HR）或非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)。
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zui近，更便宜和更容易使用的基因編輯系統(tǒng)——（CRISPR）/ CRISPR相關(guān)蛋白9（cas）系統(tǒng)，已被證明可在各種植物中實(shí)現(xiàn)的基因組編輯，包括水稻、擬南芥、煙草、小麥、高粱、玉米、番茄、苔類植物等等。由于其簡單、快速和廣泛的適用性，該系統(tǒng)已新興成為植物生物學(xué)基礎(chǔ)研究各個方面的一個有力工具。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也已成功地應(yīng)用于改良作物性狀。利用CRISPR/Cas9基因編輯，研究人員可同時靶定六倍體基因組中一個抗病基因的三個拷貝，在普通小麥中人工創(chuàng)baifeng病的性狀。該研究小組zui近的研究也表明，通過CRISPR/Cas9基因編輯可快速改良水稻中的一種抗除草劑性狀。延伸閱讀：用CRISPR編輯樹木基因組。
雖然CRISPR/Cas9已日益成功應(yīng)用于位點(diǎn)特異性的植物基因組編輯，但是大多數(shù)的數(shù)據(jù)是來自于過渡相試驗(yàn)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因事件*代。事實(shí)上，有限的研究表明，在擬南芥、煙草、番茄和水稻中，CRISPR/Cas9產(chǎn)生的靶向基因組修飾可能傳遞到下一代。在擬南芥中，早世代中的大多數(shù)突變是體細(xì)胞突變，從而使我們很難預(yù)測下一代中的靶基因型。相比之下，在水稻中通過類似的CRISPR/Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生的大多數(shù)假定純合突變，表明是胚系突變，根據(jù)經(jīng)典遺傳學(xué)理論可以進(jìn)行傳遞。
基因編輯因不同物種、靶位點(diǎn)、轉(zhuǎn)基因方法和CRISPR/Cas9構(gòu)建而有所差異，因此，作物中發(fā)生的傳遞模式仍然需要進(jìn)一步探索。此外，雖然遺傳模式已經(jīng)在擬南芥后代中深入研究，但只有初步的數(shù)據(jù)顯示了水稻后代中修飾模式的遺傳傳遞模式。因此，應(yīng)該更詳細(xì)地研究水稻后代中定向編輯的遺傳模式。
脫靶效應(yīng)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用中的另一個主要問題。在人類細(xì)胞中，脫靶突變實(shí)際上是由CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的，但是CRISPR/Cas9在植物中的特異性尚不清楚。利用深度全基因組測序和大規(guī)模篩選的獨(dú)立研究表明，脫靶突變在擬南芥、水稻和煙草中很罕見。然而，有研究小組在對一個水稻家族進(jìn)行多基因敲除的時候，觀察到了相對高頻率的脫靶突變。在動物研究中，sgRNAs的精心設(shè)計被認(rèn)為可有效避免的脫靶突變，也有研究小組開發(fā)出幾種生物信息學(xué)工具，來促進(jìn)植物中的sgRNA設(shè)計，但是其穩(wěn)定性仍有待于實(shí)驗(yàn)測試。
在這項(xiàng)研究中，研究人員借助于在線靶標(biāo)設(shè)計工具，對水稻四個不同的基因進(jìn)行了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯。在T0代中觀察到了高頻率誘變和比例較大的假定等位基因突變。而且，這些研究結(jié)果還表明，雙等位基因T0株系后代的基因型往往很難預(yù)測，突變的傳遞基本上不符合經(jīng)典的遺傳規(guī)律，這表明，T0代轉(zhuǎn)基因水稻中的突變主要是體細(xì)胞突變。
接下來，研究人員探索了T1植株的遺傳模式。不管是否存在CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因，T1株系中的突變可穩(wěn)定地傳遞給后代，從而指出了一種標(biāo)準(zhǔn)的種系傳遞模式。研究人員對脫靶效應(yīng)進(jìn)行了評價，結(jié)果表明，通過仔細(xì)選擇靶標(biāo)，在CRISPR/Cas9介導(dǎo)的水稻基因編輯中脫靶突變是很罕見的。