對(duì)不同樣品組進(jìn)行準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)定量是理解生物學(xué)的關(guān)鍵，但首先需要在樣品中鑒定到該蛋白質(zhì)。因此，對(duì)生物樣品中蛋白質(zhì)的鑒定仍然是一個(gè)重要的工作流程。
本研究應(yīng)用傳統(tǒng) DDA 工作流程（Zeno DDA）與 Zeno SWATH DIA 工作流程進(jìn)行蛋白質(zhì)、肽段鑒定。后者使用人類序列理論數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。在 45 分鐘和 10 分鐘微升液相梯度下，比較兩種工作流程在蛋白質(zhì)和肽段的鑒定水平。
● 樣品準(zhǔn)備：人 K562 細(xì)胞裂解物的酶解產(chǎn)物，來(lái)自SWATH Acquisition performance kit (SCIEX)。進(jìn)樣量范圍為 12.5 ng - 400 ng。
● 液相方法： ACQUITY UPLC M-Class液相系統(tǒng)（Waters），分析色譜柱：Phenomenex Kinetex XB-C18 (2.6 μm, 100 Å, 150 x 0.3 mm)，Trap柱：Phenomenex micro trap (5 μm, 100 Å, 10 x 0.3 mm)，流速：5 μL/min，液相梯度：10 min, 45 min。
● 質(zhì)譜方法：ZenoTOF 7600系統(tǒng)2臺(tái)，兩種采集流程：Zeno DDA、可變窗口Zeno SWATH DIA，樣品平行采集三次。
● 數(shù)據(jù)處理： Zeno DDA數(shù)據(jù)用OneOmics™軟件包中ProteinPilot™應(yīng)用程序，使用人類理論數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜庫(kù)。Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)使用DIA-NN[1]軟件處理。
分為計(jì)算機(jī)模擬譜庫(kù)（Library-free）和有譜圖庫(kù)兩種分析，其中譜圖庫(kù)使用兩種數(shù)據(jù)庫(kù)：Pan Human Library[2]和ProteinPilot™軟件搜索的人類理論數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建樣本譜圖庫(kù)。
主要結(jié)果
1. Zeno DDA與Zeno SWATH DIA
在蛋白質(zhì)鑒定的比較
在12.5ng - 400 ng進(jìn)樣量范圍內(nèi)，在相同進(jìn)樣量條件下，Zeno SWATH DIA鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量約為Zeno DDA的 2 倍， 2 臺(tái) ZenoTOF™ 7600 系統(tǒng)測(cè)試結(jié)果一致。進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)種類比較，Zeno SWATH DIA鑒定的蛋白質(zhì)幾乎覆蓋了Zeno DDA 鑒定到的蛋白質(zhì)。
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圖1. 45min液相梯度下，Zeno SWATH DIA
和Zeno DDA蛋白質(zhì)和肽段鑒定比較結(jié)果
注：左圖為蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果，右圖為肽段鑒定結(jié)果
圖2. Zeno SWATH DIA和Zeno DDA 鑒定
蛋白質(zhì)的重疊情況
2. Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)使用Library-free
處理策略和樣本譜圖庫(kù)處理策略的比較
相比于通過(guò)MS1數(shù)據(jù)進(jìn)行定量的Zeno DDA策略來(lái)說(shuō)，Zeno SWATH DIA策略可產(chǎn)生豐富的MS/MS數(shù)據(jù)，因此可獲得更可靠、更明確的定量數(shù)據(jù)。使用 Zeno SWATH DIA 工作流程時(shí)，無(wú)論使用譜圖庫(kù)還是Library-free的數(shù)據(jù)處理策略，定量CV < 20%的蛋白質(zhì)均占總鑒定蛋白質(zhì)約90% 。三種不同數(shù)據(jù)處理方法的鑒定蛋白質(zhì)數(shù)量相似，該結(jié)果顯示了Library-free處理方法的能力。
圖3. Library-free策略和 2 個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)策略
獲得的鑒定蛋白質(zhì)結(jié)果的比較
隨后比較Library-free處理生成的結(jié)果與使用譜圖庫(kù)處理的結(jié)果，維恩圖（圖 4）顯示二者得到的蛋白質(zhì)鑒定信息非常相似，進(jìn)一步增加了Library-free方法的可信度。
圖4. Zeno SWATH IDA數(shù)據(jù)使用Library-free方法
和有數(shù)據(jù)庫(kù)方法鑒定蛋白質(zhì)的重疊情況
3. 使用更快速的液相梯度
使用快速 10 min液相梯度重復(fù)本研究，以確認(rèn) Zeno SWATH DIA 工作流程在更快的液相梯度中鑒定蛋白質(zhì)數(shù)量的提升倍數(shù)。相比于 Zeno DDA 方法， 45 min液相梯度，Zeno SWATH DIA 方法蛋白質(zhì)鑒定量提升約2倍（圖 5）。隨著液相梯度加快， 使用Zeno SWATH DIA可獲得更大蛋白質(zhì)鑒定增益，蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量增加到 2.5倍 -3 倍。因此，當(dāng)進(jìn)行大樣本分析時(shí)，更適合選用Zeno SWATH DIA工作流程。
圖5. 10 min和45 min液相梯度，
蛋白質(zhì)和肽段鑒定數(shù)量的比較
文獻(xiàn)：
[1] Demichev V et al. (2019) DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods, 17, 41-44.
[2] Rosenberger G et al (2014) A repository of assays to quantify 10,000 human proteins by SWATH-MS. Scientific data. 1, 140031.
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